[目的]牙周炎是人类最为普遍的疾病之一,是成人失牙的主要原因,往往会导致结缔组织和骨组织不可逆丧失。目前,临床上针对牙周炎的治疗方式主要有龈上洁治、龈下刮治、翻瓣术等,但未能真正实现牙周组织再生。外泌体（exosomes）作为全新的细胞间通讯载体,在促进组织修复中展现出了巨大潜能,为实现组织再生提供了新思路。目前,外泌体在牙周组织中的研究相对较少。牙囊干细胞（dental follicle stem cells,DFSCs）作为多种牙周支持组织的前体细胞,具有成骨、成牙骨质、成牙周膜向分化的潜能。课题组前期利用牙囊干细胞膜片成功再建了犬牙周组织,然而具体的机制仍不清楚。已经证实外泌体可以通过促进细胞增殖、迁移,抑制细胞凋亡,调节炎症及免疫反应,从而促进组织修复和再生。因此,我们猜想外泌体是否是牙囊干细胞发挥促牙周再生作用的关键。于是本课题以牙囊干细胞来源的外泌体（DFSCs-exosomes）作为主要研究对象,通过体外实验探究DFSCs-exosomes对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）增殖、迁移、成骨分化等生物学特性的影响,通过体内实验验证DFSCs-exosomes再生牙周组织的可能,从而为探索无细胞移植技术再生牙周组织提供理论基础。[方法]1.使用改良组织块法培养DFSCs和PDLSCs,通过多向分化诱导、克隆形成、流式细胞术和免疫荧光对细胞进行鉴定;2.从DFSCs培养上清液中提取DFSCs-exosomes,对DFSCs-exosomes形态、粒径大小及标记分子进行鉴定,通过免疫荧光观察PDLSCs对DFSCs-exosomes的摄取情况;3.通过EdU实验、CCK-8实验及细胞周期实验检测DFSCs-exosomes对PDLSCs增殖能力的影响,通过划痕实验检测DFSCs-exosomes对PDLSCs迁移能力的影响,通过茜素红染色检测DFSCs-exosomes对PDLSCs矿化能力的影响,通过qRT-PCR和Western blot 检测 DFSCs-exosomes 对 PDLSCs 成骨相关基因和蛋白（COL1、ALP、RUNX2、BSP）表达水平的影响;4.通过转录组测序研究DFSCs-exosomes对PDLSCs的影响,并通过Western blot、EdU实验和CCK-8实验对其中MAPK通路激活情况及其对PDLSCs的增殖影响进行验证;5.构建SD大鼠牙周缺损模型,通过micro-CT、HE染色评估DFSCs-exosomes修复牙周缺损的效果。[结果]1.本实验培养的DFSCs和PDLSCs呈典型的成纤维细胞样形态,阳性表达间充质干细胞特异性标记物Nestin、Vimentin、CD146,并具备克隆形成能力及成骨/成脂向分化能力,流式细胞术检测发现两种细胞均阳性表达CD29、CD44、CD90和CD105,阴性表达CD34和CD45,表明所培养的DFSCs和PDLSCs均具备间充质干细胞的特征;2.DFSCs-exosomes呈典型的茶托样形态,粒径峰值在132.7nm左右并阳性表达外泌体标记分子CD81、TSG101和HSP90,免疫荧光结果表明PDLSCs能逐渐摄取DFSCs-exosomes;3.EdU实验、CCK-8实验表明10μg/mL的DFSCs-exosomes明显促进PDLSCs增殖,细胞周期实验表明DFSCs-exosomes增加PDLSCs中S期及G2期的比例,提示其增殖活性增强,划痕实验表明10μg/mL的DFSCs-exosomes能明显促进PDLSCs迁移,成骨诱导系列实验表明DFSCs-exosomes促进PDLSCs矿化结节形成,并能不同程度上调PDLSCs中成骨相关基因及蛋白的表达;4.转录组测序结果表明DFSCs-exosomes 能上调 PDLSCs 中的 234 个 mRNA,下调 134 个 mRNA,差异表达显著的基因主要与MAPK、mTRO、cMAP等通路相关,进一步验证发现DFSCs-exosomes可以激活PDLSCs中的p38 MAPK通路,从而促进PDLSCs增殖;5.DFSCs-exosomes移植到缺损部位后可以被缺损部位周围的宿主细胞摄取,micro-CT结果表明DFSCs-exosomes能促进大鼠缺损牙周组织形成新骨,HE染色结果表明DFSCs-exosomes能促进大鼠缺损牙周组织形成新牙周膜样结构。[结论]1.改良组织块法成功培养出DFSCs和PDLSCs;2.PDLSCs可以摄取 DFSCs-exosomes;3.10μg/mL 的 DFSCs-exosomes 可以促进 PDLSCs 增殖、迁移及成骨分化;4.DFSCs-exosomes至少部分通过激活p38 MAPK通路促进PDLSCs增殖;5.在本实验条件下,DFSCs-exosomes能够有效修复缺损牙周组织。