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脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,Fhit）基因是1996年Ohta等人用外显子捕获法克隆并鉴定出来的第一个普通型脆性位点基因,该基因横跨脆性位点FRA3B,定位于染色体3p14.2上。经细胞生物学、肿瘤分子生物学研究,并通过转基因、基因敲除等技术证实其为一种新的抑癌基因,与肿瘤的发生发展密切相关。已经发现在大约70%的人类上皮肿瘤尤其是环境致癌物诱发产生的肿瘤中出现Fhit基因缺失、甲基化及Fhit蛋白表达减少。研究认为Fhit通过Fhit-底物复合物产生抑癌作用,但Fhit特异的信号通路及影响肿瘤发展的作用机制还不清楚。我们前期的研究发现与野生型Fhit+/+相比,具有过激活ATR/CHK1通路的Fhit-/-细胞突变率增加并且对DNA损伤诱导剂的耐受性更强。为了弄清Fhit如何影响ATR/CHK1通路,我们通过免疫共沉淀技术筛选ATR/CHK1通路相关蛋白,发现Fhit能够与复制蛋白A （Replication protein A,RPA）相互作用,而RPA是具有多重功能的蛋白,其在真核DNA复制、修复、重组以及DNA损伤后的信号通路调节过程中起着重要作用。ATR的激活就是通过ATRIP （ATR interacting protein）识别RPA而感应DNA损伤的,又RPA在DNA损伤后对ATR的激活是非常关键的。因此,研究Fhit与RPA的相互作用在细胞对DNA损伤应答中的作用机制就显得非常重要。在用GST沉降方法、免疫共沉淀技术确定了Fhit与RPA在体内及体外均能够发生相互作用之后,为了鉴定Fhit与RPA相互作用的关键区域或关键氨基酸残基,我们进一步用GST沉降方法对一系列Fhit缺失突变体进行分析,发现Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基可能是Fhit蛋白的I113Y114。因为酪氨酸Y是高度保守的氨基酸,Fhit第114位酪氨酸Y能被Src家族酪氨酸激酶磷酸化,即Fhit是Src蛋白激酶的酪氨酸磷酸化靶标,因此Fhit Y114极有可能是Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。我们选择与Y结构相近的氨基酸（F苯丙氨酸及D天冬氨酸）和结构简单的氨基酸（A丙氨酸）进行突变,鉴定Y114残基是否是Fhit与RPA的相互作用的关键氨基酸残基,进而为研究Fhit对ATR/CHK1通路的影响机制奠定基础。本研究通过将Fhit蛋白Y114突变为氨基酸A、D和F来探索Fhit突变体在DNA损伤应答中的作用机制。首先设计了一系列引物,通过PCR方法对Fhit蛋白Y114氨基酸残基进行点突变,经重组PCR方法扩增出目的片断,成功构建了三种Fhit突变体基因:FhitA、FhitD和FhitF,将其插入含GST基因的pGEX-KG原核表达载体中,在大肠杆菌中表达纯化GST-Fhit突变体融合蛋白GST-FhitA、GST-FhitD以及GST-FhitF,用GST沉降技术研究了Fhit突变体与RPA是否在体外存在相互作用。实验结果表明野生型GST-Fhit融合蛋白与RPA能够发生相互作用,而GST-Fhit突变体融合蛋白与RPA之间的相互作用要比野生型GST-Fhit融合蛋白与RPA之间的相互作用弱很多（表达量一致的前提下,检测出的RPA蛋白信号比野生型的弱很多,GST-FhitF和GST-FhitD与阴性对照GST的信号相似）,说明位于Fhit蛋白C端的第114位氨基酸残基是影响Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。将构建的三种含Fhit突变体基因的原核表达载体进行双酶切,获得目的片断,将其插入携带HA标签的pREP10的真核表达载体中,构建了三种含Fhit突变体基因的真核表达载体。用Lipfectamine 2000转染试剂转染HeLa细胞后,建立了稳定表达Fhit突变体的细胞系,各选取一株外源基因表达较高的细胞株进行后续的实验研究,所选的细胞为A2、D1和F2。通过免疫荧光染色、克隆形成实验、MTT实验及细胞周期检测,发现与表达野生型Fhit的人细胞相比,表达突变体Fhit的人细胞表现出对DNA损伤诱导剂更强的耐受性以及电离辐射后更强的G2期阻滞,这与Fhit缺失细胞表现出的表型相似,提示突变了Fhit蛋白第114位氨基酸残基后细胞在对DNA损伤诱导剂的耐受性及细胞周期的分布上发生了改变,说明Fhit与RPA的相互作用影响了细胞对DNA损伤诱导剂诱导的损伤的敏感性及细胞周期的分布。本研究利用GST沉降技术进一步鉴定了Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,发现Fhit蛋白Y114残基突变后影响了Fhit与RPA的相互作用。通过体内实验研究了稳定表达Fhit突变体的细胞及稳定表达野生型Fhit的细胞在DNA损伤诱导剂处理后细胞对DNA损伤诱导剂敏感性的变化及细胞周期分布的变化,发现表达Fhit突变体的细胞与表达野生型Fhit的细胞相比对DNA损伤诱导剂具有更强的耐受性以及电离辐射后具有更强的G2期阻滞,这些结果提示Fhit是通过与RPA的相互作用而影响了ATR/CHK1通路。我们的结果为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索,也为研究Fhit在抑制肿瘤的发生发展中的作用奠定了基础。