【摘 要】
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目的本研究探讨hsa＿circ＿0043533/miR-409-3p/Bcl-2 ceRNA调控网络对人卵巢颗粒细胞增殖凋亡的影响,以及二甲双胍对此调节轴的干预作用,并分析其可能的分子机制,为PCOS发病机制及药物治疗提供新的认识。方法体外培养人卵巢颗粒细胞系（KGN、COV434）和人正常卵巢上皮细胞系（IOSE80）。从细胞中提取RNA,用实时荧光定量PCR检测hsa＿circ＿0043533
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目的本研究探讨hsa＿circ＿0043533/miR-409-3p/Bcl-2 ceRNA调控网络对人卵巢颗粒细胞增殖凋亡的影响,以及二甲双胍对此调节轴的干预作用,并分析其可能的分子机制,为PCOS发病机制及药物治疗提供新的认识。方法体外培养人卵巢颗粒细胞系（KGN、COV434）和人正常卵巢上皮细胞系（IOSE80）。从细胞中提取RNA,用实时荧光定量PCR检测hsa＿circ＿0043533在正常卵巢表面上皮细胞（IOSE80）和颗粒细胞（KGN和COV434）中的表达并进行对比。根据在hsa＿circ＿0043533的环化组拼位点设计siRNA,在体外实验KGN细胞中转染hsa＿circ＿0043533 siRNA和hsa＿circ＿0043533 siRNA-NC,并通过Q-PCR检验证明其有效性。实验对象包括si-circ＿0043533组（hsa＿circ＿0043533 siRNA）、si-NC组（hsa＿circ＿0043533 siRNA-NC）和WT组（非转染）,以及在实验KGN细胞中用CCK8、EDU实验和流式细胞技术研究hsa＿circ＿0043533对颗粒细胞生长和凋亡的影响。Western blot检测各组Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达的变化。利用双荧光素酶报告基因分析hsa＿circ＿0043533与miR-409-3p以及miR-409-3p与Bcl-2之间是否存在结合关系,通过CCK8、EDU实验和流式细胞技术研究miR-409-3p inhibitor是否可以恢复hsa＿circ＿0043533低表达对KGN细胞的影响,并通过Q-PCR验证miR-409-3p在PCOS样本（n=20）和正常健康对照样本（n=20）中的表达情况并分析其临床意义。通过CCK8实验来测定用不同含量（2.5m M、5.0m M、10.0m M、20.0m M、40.0m M）的二甲双胍作用KGN细胞24h、48h和72h的细胞活性并估算药物的半抑制浓度(IC50)的值;利用流式细胞术测定KGN细胞的凋亡量;以及EDU实验观察该细胞的生长状况;Q-PCR检测二甲双胍作用下KGN细胞中miR-409-3p表达水平。结果与IOSE80及COV434细胞系相比,hsa＿circ＿0043533在KGN细胞系中的表达水平明显升高。与si-NC与WT组相比,hsa＿circ＿0043533 siRNA可在KGN细胞中有效沉默hsa＿circ＿0043533。EDU实验与CCK8实验结果显示,si-circ＿0043533组KGN细胞的增殖活性明显降低,流式细胞术检测显示,si-circ＿0043533组KGN细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义（P值均＜0.05）。Western blot蛋白结果显示,si-circ＿0043533组内的凋亡相关蛋白质表达:Bcl-2蛋白质表达下调,Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2比值升高,Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白质表达上调。双荧光素酶报告基因分析结果提示hsa＿circ＿0043533能够通过结合位点吸附miR-409-3p,miR-409-3p在体外直接靶向Bcl-2。Q-PCR证实,PCOS组的卵巢颗粒细胞中miR-409-3p的相对表达量明显低于正常对照组（P＜0.01）。同时,miR-409-3p inhibitor逆转了hsa＿circ＿0043533低表达对KGN细胞增殖凋亡的影响。二甲双胍可能通过浓度依赖性方式抑制KGN细胞增殖并促进其凋亡,二甲双胍也可以促进KGN细胞中miR-409-3p的表达。结论Hsa＿circ＿0043533/miR-409-3p/Bcl-2 ceRNA调控网络可能是通过线粒体凋亡通路对人卵巢颗粒细胞增殖凋亡产生影响,从而参与到PCOS疾病的发生与发展。二甲双胍可能是通过上调miR-409-3p表达干预调节轴,抑制颗粒细胞增殖和促进细胞凋亡,对PCOS患者异常排卵的恢复起到了积极的作用。
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