地黄是玄参科多年生草本植物,是我国常用大宗药材之一。但在地黄的生产中受到连作障碍的长期影响,造成地黄植株瘦弱,须根增多,块根膨大发育不良,造成地黄产量和品质的下降,更有甚者是造成绝收,且危害期长,可持续长达8-10年。连作障碍已成为制约我国地黄产业发展的重大问题。以往的研究主要集中连作后土壤环境的变化及植株体内基因表达的差异,而连作地黄体内蛋白质的差异表达谱,尤其是磷酸化蛋白表达谱的研究却鲜有报道。本研究采用iTRAQ技术构建连作地黄特异表达蛋白谱,分析连作地黄与对照地黄在膨大前期的磷酸化蛋白质的表达差异,以期获得地黄根部响应连作的磷酸化修饰蛋白及其信号转导系统。本研究的主要内容如下:1、连作地黄根部差异磷酸化蛋白质的鉴定利用iTRAQ技术对蛋白质进行磷酸化分析及相对定量,鉴定出Global FDR Fit<1%的蛋白质数目为1787个。根据Unused>1.3,肽段数≥1,去除带“R”的反库数据以及没有定量表达值得空白数据,共筛选到1363个可信蛋白。采用p-value<0.05且变化倍数为1.2倍的标准筛选差异蛋白,即p-value小于0.05,同时变化倍数大于1.2倍或小于0.83的数据为差异表达磷酸化蛋白。满足要求的蛋白即被列出,上调(即倍数大于1.2),下调(即倍数小于0.83)。并且Dynamics中进行了动态分析,对同一蛋白在不同比较组中进行了分析,在任意一组中为差异蛋白的蛋白均被列出。共筛选到PTR_PCR(头茬比重茬)有78个,其中30个上调表达,48个下调表达。2、连作地黄根部差异磷酸化蛋白质的功能分析对地黄根部连作差异表达磷酸化蛋白进行KEGG pathway分析发现,差异表达磷酸化蛋白的分布在20个代谢通路中,主要的代谢途径有:代谢途径、次级代谢途径、核糖体生物合成、植物病原菌互作、内质网蛋白合成、信号转导途径等。其中代谢途径中有6个差异表达磷酸化蛋白,分别为:NADP-ME4、SPS1、dl4665w、TPS5、UKL1和PLC2,只有dl4665w下调表达,其他均是上调表达;信号转导途径有9个差异表达磷酸化蛋白,分别为:EHD2、EPSIN2、AGD12、PEN2、PLC2、AGD9、AGD6、CRT2和TUBA6,其中前5个上调表达,后4个下调表达;内质网蛋白合成相关的有3个,分别为:PUX4、CRT2和At1g19130,3个全部是下调表达;植物病原菌互作相关的有2个,分别为:CPK6和MKK2,均是上调表达。对PTR_PCR的78个差异表达蛋白进行蛋白互作分析发现有34个蛋白能相互作用。互作蛋白主要参与的代谢通路有:内质网蛋白合成,吞噬体,植物病原菌互作,内吞作用,剪接体,肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇信号通路。3、形成地黄连作障碍可能的关键信号途径本研究在特异响应地黄连作障碍的磷酸化蛋白中发现,磷脂酰肌醇信号途径中有两个连作差异磷酸化蛋白,分别是PEN2和PLC2,均被显著上调表达,表明IP3信使的产生,开启钙通道,在传递胞外地黄连作障碍自毒物质到胞内以及活化钙通道,增加地黄胞内钙离子浓度起着关键的作用。由此表明磷脂酰肌醇信号系统在地黄连作障碍中的地黄本身对自毒物质的应激反应起着重要作用。同时,还发现的4个磷酸化蛋白,ACA9、MKK2、CPK6和CRT2,均与钙信号通路有关,前3个显著上调且被定位在细胞质膜中,CRT2显著下调,猜测这些蛋白的磷酸化造成了钙信号系统的紊乱,加剧了地黄连作的发生,表明地黄连作中Ca信号对逆境信号的传递与运输起到重要的作用。