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柯萨奇B3型病毒（coxsackievirus B3type, CVB3）是病毒性心肌炎（VMC）最常见的病原体，它属于细小RNA病毒科肠道病毒属，是CVB6个血清型中致病性最强的一型，其感染与急、慢性心肌炎和扩张性心脏病关系紧密。目前对CVB3的结构和致病机理有所了解，但临床上尚无有效的治疗和预防措施，因此新型、高效的疫苗对于预防病毒性心肌炎显得尤为必要。我们前期工作制备了旨在诱导特异性黏膜免疫的新型病毒性心肌炎DNA疫苗chitosan-pVP1（简称chi-pVP1）。该疫苗由编码CVB3结构蛋白VP1的质粒DNA和作为黏膜递送系统的天然生物多糖chitosan两部分组成，通过滴鼻免疫可保护33%的小鼠免于致死性病毒攻击。为了进一步增强该疫苗的黏膜免疫应答，提高免疫保护力，我们拟在原有疫苗系统中引入靶向M细胞的多肽CPE30，期望设计一种新型的黏膜递送系统，通过全面增强全身及黏膜免疫应答，以达到更好预防病毒性心肌炎的效果。共获得如下结果:一、chi-CPE30-DNA递送系统的构建及生物学活性研究化学偶联法制备chi-CPE30后，通过共凝聚法形成chi-CPE30-pVP1复合物颗粒，然后检测纳米粒的生物学特性，我们发现：1）经过EDC/NHS化学偶联试剂的偶联作用，接近70%的CPE30与chi偶联。2）chi-CPE30包裹DNA的效率接近100%，并且chi-CPE30能在一定程度上保护DNA免遭DNA酶的降解。3）将一定浓度的pVP1溶液，在pH5.5和高速振荡下，逐滴加入配好的0.02%的chi-CPE30溶液，可形成chi-CPE30-pVP1复合物颗粒，扫描电镜证实复合物为均一的球形颗粒，大小在200-400nm，带正电荷。二、滴鼻免疫诱生的CVB3特异性免疫应答及免疫保护以chi-CPE30-pVP1、chi-pVP1、chi-CPE30-pcDNA3.1和chi-pcDNA3.1四种疫苗分别于0、2、4、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠，每次每种质粒50μg，共4次。检测特异性抗体水平及细胞免疫应答，我们发现：1）chi-CPE30-pVP1疫苗滴鼻免疫后，诱生了高水平的血清IgG和黏膜IgA抗体。2）chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫促进了CVB3特异性血清IgG和粪便IgA抗体亲和力成熟。3）特异性淋巴细胞增殖实验发现，chi-CPE30-pVP1有效诱生了脾脏和MLN部位的CVB3特异性淋巴细胞增殖反应。4）特异性CTL活性检测发现，与chi-pVP1相比，chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫能够诱导较强的脾脏和MLN部位特异性CTL的产生。5）ELISPOT结果显示，与chi-pVP1单独免疫组相比，chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫可有效增加脾脏及MLNIFN-γ分泌细胞的数量，提示chi-CPE30-pVP1促进了小鼠抗病毒能力。接着，按照我们上述同样的方法滴鼻免疫小鼠，观察免疫保护作用，获得如下结果：1）3LD50CVB3腹腔感染4天后，以体重减轻率衡量小鼠发病情况，对照组小鼠在感染后第4天体重明显下降，而chi-CPE30-pVP1免疫组小鼠感染后体重改变轻微，仅为4.76%。2）以血清学指标来衡量小鼠心肌损伤程度：chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫组小鼠的CK和CK-MB显著低于chi-pVP1组和对照组小鼠。3）取感染后7天的小鼠心脏，观察心肌病理学改变，结果显示：chi-CPE30-pVP1组心肌病理改变最轻，近似于正常，提示chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫疫苗提供了最有力的免疫保护。4）胰腺组织病理观察结果与心肌组织类似，对照组小鼠胰腺腺泡被大量破坏，几乎未见正常组织结构；chi-pVP1免疫组腺泡组织破坏较轻，但有大团炎性浸润，范围较广；chi-CPE30-pVP1组小鼠腺泡结构完整，未见组织坏死，仅可见少量炎症细胞浸润。5）以TCID50测定感染小鼠组织病毒载量，结果显示，chi-CPE30-pVP1组与chi-pVP1组相比，心脏和胰腺组织病毒载量明显较低。提示chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫组诱生的全身及黏膜局部免疫应答能够有效清除病毒。6）以5LD50CVB3病毒攻击后，观察28天小鼠存活情况，发现chi-CPE30-pVP1滴鼻免疫组42%小鼠实现了长期存活；与对照组相比有明显差异。三、评估25μg口服免疫诱生的CVB3特异性免疫应答及免疫保护以chi-CPE30-pVP1、chi-pVP1、chi-CPE30-pcDNA3.1和chi-pcDNA3.1四种疫苗分别于0、2、4、6周口服免疫BALB/c小鼠，每次每种质粒25μg，共4次。检测CVB3特异性免疫应答及免疫保护，评估口服免疫效果。我们发现：1）chi-CPE30-pVP125μg口服免疫后，诱生了较高水平的血清IgG和黏膜IgA抗体。2）特异性淋巴细胞增殖实验发现，chi-CPE30-pVP1显著诱生了脾脏及MLN部位的CVB3特异性淋巴细胞增殖反应。3）ELISPOT结果显示，与chi-pVP1单独免疫组相比，chi-CPE30-pVP1口服免疫可显著增加脾脏及MLN IFN-γ分泌细胞的数量，有助于抗病毒。4）取感染后7天的小鼠心脏和胰腺，观察病理学改变，结果显示：chi-CPE30-pVP1口服免疫组心脏和胰腺近似于正常，提示口服免疫该疫苗提供了高效的免疫保护。5）以免疫组化检测感染后口服免疫小鼠心肌细胞内病毒，结果显示，chi-CPE30-pVP1免疫小鼠心肌细胞正常清晰，未见有病毒颗粒染色。提示chi-CPE30-pVP1疫苗可诱生更有效的抗病毒免疫应答，从而在CVB3攻击后4天，心肌内较好地清除了感染病毒。四、chi-CPE30-pVP1增强黏膜免疫应答的机制探讨从体外和体内两个方面证明新型黏膜疫苗的靶向递送作用对其增强黏膜免疫应答和免疫保护具有重要意义。获得如下结果：1) FITC-chi-CPE30-DNA结合转染claudin4的293T细胞的能力更强。2)体内小肠M细胞靶向实验证明chi-CPE30-DNA M细胞摄取量明显多于chi-DNA。本研究首先成功构建了新型M细胞靶向性黏膜递送系统，然后将chi-CPE30-pVP1免疫小鼠，详细观察了滴鼻免疫诱生的CVB3特异性全身和黏膜免疫应答及免疫保护，并且简单评估及预测了口服chi-CPE30-pVP1疫苗能够诱生更强的黏膜免疫应答，最后在前面研究的基础上探讨了该新型黏膜疫苗发挥免疫效应的潜在机制。本研究为新型疫苗的分子设计和CVB3感染的防治提供了新的免疫手段，同时可能创建一有助于增强黏膜免疫的技术平台。