肠杆菌科细菌分布广、种类多、与人类关系密切,是细菌感染的最常见病原菌,并以多重耐药菌株引起的感染为显著特点。超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-Lactamases, ESBLs)是一类主要由肠杆菌科细菌产生,能够水解包括第三和第四代头孢菌素在内的β-内酰胺类抗菌药物,但可以被克拉维酸抑制的一类酶家族。目前已报道的ESBLs中包括TEM型94种；SHV型44种；CTX-M-型121种；OXA型18种,其他基因型近12种(http://www.lahey.org/studies)。不同的国家、地区或医院因其使用抗菌药物的种类不同,而表现出不同的ESBLs发生率及基因型。SHV型酶是革兰阴性菌中发现最早,也是最常见的β-内酰胺酶之一。目前已经公布的SHV型酶已经超过了140种,且新亚型酶依然在不断被发现。根据水解底物的不同,SHV型酶可以分为广谱酶、超广谱酶和酶抑制剂耐药型酶。SHV型ESBLs在全球广泛分布,但各地流行的基因亚型不尽相同。近几年来,我国有关此酶的报道明显增多,并分离到多种SHV亚型酶。由于ESBL确证试验存在一定的缺陷,CLSI综合评价了第三代和第四代头孢菌素药效学和药动学对临床疗效的影响后,决定在2010年降低肠杆菌科细菌对部分头孢菌素和氨曲南药敏判定的折点,同时不再推荐临床微生物实验室进行ESBL确证试验,仅用于流行病学和感染控制的目的。尽管已经降低了部分抗菌药物的折点,仍有报道称按照修改后的折点无法检测出全部的产ESBLs菌株。除了产生β-内酰胺酶外,细菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)功能的改变或缺失也是引起耐药性变化的重要原因。外膜孔蛋白常以同三聚体的形式存在,聚集起来形成孔道,允许小分子亲水性物质包括大多数抗菌药物的跨膜扩散。它们具有特定的透过率,而通透性的不同对耐药的产生及耐药程度的高低均起到重要作用。随着碳青霉烯类抗菌药物使用的不断增加,临床上已经出现了越来越多对其耐药的肠杆菌科细菌,产碳青霉烯酶是最主要的耐药机制。然而,碳青霉烯酶的检测却十分困难。为了避免漏筛,CLSI在2009年推荐使用改良Hodge试验检测产碳青霉烯酶菌株。虽然该试验的敏感性和特异性均超过90%,依然有报道出现一定比率的假阳性或假阴性结果。基于此,本课题收集了ESBL确证试验阳性菌株共382株。其中,2008年大肠埃希菌158株和肺炎克雷伯菌164株,2007年和2008年奇异变形杆菌共60株。分析了2010年CLSI新折点对产ESBLs菌株药敏判定的影响、SHV新亚型酶SHV-136及SHV-137的特点、氨曲南敏感的产ESBL奇异变形杆菌中外膜孔蛋白OmpF的氨基酸序列改变和产ESBLs合并外膜蛋白缺失对改良Hodge试验假阳性的影响。为针对产ESBLs菌株感染的抗菌药物合理选用提供依据,对临床耐药菌产ESBL全面的了解及碳青霉烯酶的准确检测,降低医院感染的发生率和病死率有重要意义。第一部分2010年CLSI新折点对产ESBLs的肠杆菌科细菌药敏结果判定的影响(一)产ESBL肠杆菌科细菌的基因型分析1.在382株产ESBLs细菌中,有363株经PCR检测确定了ESBLs基因型,有3株大肠埃希菌、14株肺炎克雷伯菌和2株奇异变形杆菌未检测到ESBLs基因。2.单独检出blaCTx-M或合并blaSHV ESBLs的菌株占全部菌株的92.7%,其中有98.1%的大肠埃希菌和96.7%的奇异变形杆菌仅携带CTX-M-基因。3.48.2%的肺炎克雷伯菌中发现有CTX-M-1组ESBLs,明显高于CTX-M-9组的发生率(P<0.01)；72.8%的大肠埃希菌和91.7%的奇异变形杆菌中发现有CTX-M-9组ESBL,明显高于CTX-M-1组的发生率(P<0.01)。CTX-M-2组和CTX-M-8组ESBLs未检测到。4.有26.2%的肺炎克雷伯菌检出SHV型ESBLs或同时合并CTX-M型ESBLs,包括29株SHV-12,10株SHV-2,2株SHV-31,1株SHV-136和1株SHV-137；66.5%的肺炎克雷伯菌单独携带CTX-M-基因；4.3%的菌株单独携带SHV ESBLs;22%的菌株同时检出CTX-M-和SHV二种ESBLs基因型。未在大肠埃希菌和奇异变形杆菌中检测到SHV型ESBLs。5.在1株肺炎克雷伯菌中发现了1个TEM新亚型酶基因,经Jacoby G A教授命名为TEM-183(GenBank登录号HQ529916),为广谱酶。(二)产ESBL肠杆菌科细菌对部分头孢菌素类及氨曲南的敏感性1.使用新的CLSI折点,382株产ESBLs的细菌对头孢唑啉、头孢噻肟和头孢曲松均判定为耐药。2.91.7%,85%和96.7%的奇异变形杆菌分别对头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南判定为敏感。有45.6%和41.8%的大肠埃希菌分别对头孢他啶和头孢吡肟判定为敏感。有20.1%的肺炎克雷伯菌对头孢吡肟显示敏感。3.总的来看,肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率明显高于大肠埃希菌,而产CTX-M-1组酶菌株比CTX-M-9组酶对β-内酰胺类抗菌药物更耐药。在290株单独携带CTX-M-1组或CTX-M-9组的菌株中,有41%-68%携带CTX-M-9组酶基因的菌株对氨曲南、头孢吡肟和头孢他啶敏感,而在携带CTX-M-1组酶基因的菌株中,对上述3种抗菌药物的敏感率仅为3%-14%。在99株产CTX-M-9组酶的大肠埃希菌中,有22株对上述三种药都敏感,有11株对头孢他啶和头孢吡肟敏感,对氨曲南耐药。在40株产CTX-M-1组酶的大肠埃希菌中,有20株对上述三种抗菌药物均耐药,有8株对头孢他啶和氨曲南耐药而对头孢吡肟中介耐药。尽管2010年CLSI降低了部分抗菌药物的折点,依然有一定比例的产ESBLs肠杆菌科细菌会被报告对部分头孢菌素类或氨曲南敏感。不同ESBLs基因型或菌种对不同抗菌药物的药敏结果存在很大的差异。CTX-M型ESBLs流行的国家或地区,头孢噻肟的敏感性很好地反映菌株是否产ESBLs。第二部分ESBL新基因亚型SHV-136和SHV-137的发现及其特性研究在两株肺炎克雷伯菌K-83及K-158中发现了2个SHV新亚型酶基因,经美国Jacoby GA教授命名为SHV-136(GenBank登录号HQ661362)及SHV-137(HQ661363)(http://www.lahey.org/studies)。1.SHV-136及SHV-137的氨基酸序列：通过PCR产物的测序、比较,SHV-136是在广谱酶SHV-25氨基酸序列的基础上,第22位的丙氨酸被缬氨酸替代。SHV-137是在广谱酶SHV-1氨基酸序列的基础上,第147位的甘氨酸被丙氨酸替代,同时第254位天冬酰胺被组氨酸替代。2.SHV-136及SHV-137的克隆和ESBL的确定：将SHV-136和SHV-137的全基因序列分别连接入质粒载体pHSG398后转化入感受态细胞Top10,并成功表达。两个克隆株的ESBLs确证试验显示头孢他啶/克拉维酸的MIC较单药头孢他啶的MIC降低了8倍,故SHV-136及SHV-137均被判定为ESBL。3.SHV-137中决定ESBL特性突变位点的确定：将SHV-137较SHV-1突变的两个位点,分别成功恢复成与SHV-1相对应的氨基酸,即SHV-137-M1(A147G)和SHV-137-M2(H254N),并测序验证了序列。通过ESBL双纸片确证试验确定SHV-137中第147位的甘氨酸被丙氨酸替代是导致其成为ESBL的关键位点。4.β-内酰胺酶等电点的分析：SHV-136的等电点是7.5,而SHV-137的等电点是7.6。5.SHV-136和SHV-137克隆株的药敏及酶稳定性：琼脂稀释法药敏试验结果显示,携带SHV-136和SHV-137酶基因的两个克隆株对多种β-内酰胺类及其酶抑制剂合剂的药敏类似。对青霉素类、第一代头孢菌素均表现耐药；对第二代、第三代和第四代头孢菌素表现为敏感但是较感受态细胞TOP10的MIC有明显升高。克拉维酸对两个SHV亚型酶的抑制作用十分明显,阿莫西林/克拉维酸合剂的MIC较阿莫西林单药降低64倍；而舒巴坦和他唑巴坦对两个亚型酶的抑制作用较差,对氨苄西林/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的MIC均超过256μg/ml。特别是对含有他唑巴坦的酶抑制剂合剂的耐药,是很少见的情况。第三部分氨曲南敏感的产ESBLs奇异变形杆菌中外膜孔蛋白OmpF序列的改变在第一部分的研究中我们发现有14株单独产CTX-M-9组ESBL的奇异变形杆菌对氨曲南的MIC仅为0.04或0.06μg/ml,而对头孢噻肟和头孢吡肟依然表现为耐药。我们对这些细菌的外膜蛋白进行了研究。随机选择了单独产CTX-M-9组ESBL的奇异变形杆菌共15株,其中,氨曲南MIC为0.04μg/ml、0.06μg/m、0.5μg/ml、1μg/ml和2μg/ml的细菌各3株。SDS-PAGE蛋白电泳未发现这些细菌外膜蛋白的缺失或明显减少。并且,fadL、ompA、ompF、 ompW和tolC这五种编码奇异变形杆菌主要外膜孔蛋白基因的表达水平均未发现明显差异。我们扩增了39株(包括上述15株菌)氨曲南MIC为0.04μg/m、0.06μg/ml、0.5μg/ml、和2μg/ml的奇异变形杆菌OmpF全基因序列,与奇异变形杆菌标准株ATCC29906比较后发现：在氨曲南MIC为0.04和0.06μg/ml的菌株中,均存在相同的OmpF氨基酸序列的改变,其中突变了30个氨基酸,插入了3个氨基酸,缺失了7个氨基酸,同源性为88.5%,而氨曲南MIC为0.5μg/ml和2μg/ml的菌株OmpF的氨基酸序列与ATCC29906完全相同。全部菌株OmpF的调控子OmpR的氨基酸序列均未发生突变。第四部分产ESBLs合并外膜蛋白缺失对改良Hodge试验检测碳青霉烯酶的影响选择第一部分研究的细菌中对碳青霉烯类敏感的所有大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共301株,其中大肠埃希菌153株、肺炎克雷伯菌148株。琼脂稀释法药敏结果显示所有菌株对头孢唑啉和头孢噻肟耐药,62.1%的菌株对头孢他啶耐药,48.2%的菌株对头孢吡肟耐药。受试细菌中均未扩增出碳青霉烯酶基因。其中,有93%的菌株携带CTX-M-型ESBLs,包括135株CTX-M-14,占48.2%,112株CTX-M-15,占40%,2株CTX-M-25,占0.7%,28株同时携带CTX-M-14和CTX-M-15,占10%,3株CTX-M-14和CTX-M-25,占1.1%。有11.3%的菌株同时包含SHV和CTX-M型ESBLs。虽然所有菌株都对碳青霉烯类抗菌药物敏感并且碳青霉烯酶基因型阴性,改良Hodge试验依然出现了3.3%(10/301)的假阳性结果。除了1株是产SHV-12型ESBL外,其余9株假阳性菌株均是产CTX-M-型ESBLs。提取10株改良Hodge试验假阳性菌株的外膜蛋白,SDS-PAGE电泳发现有9株细菌存在1个或2个外膜蛋白的缺失。提示产ESBLs同时合并外膜蛋白缺失可能是假阳性结果发生的原因。