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肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是导致缺血性急性肾衰竭(acute renal failure, ARF)的主要原因,肾小管上皮细胞凋亡是其重要发生机制之一。过度的内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)可引起细胞凋亡,参与肾缺血再灌注损伤。牛磺酸(taurine, Tau)具有调节细胞内钙稳态、抗炎和抗氧化等作用。本实验旨在建立大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)和大鼠急性肾缺血再灌注损伤两种模型基础上,从内质网应激角度,研究牛磺酸对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制,为临床上防治肾缺血再灌注损伤提供实验依据。本课题研究包括以下三个部分:第一部分:不同的缺氧复氧时间对肾小管上皮细胞的影响。目的:建立一个较理想的肾小管上皮细胞H/R模型并筛选出一个合适的肾小管上皮细胞H/R时间。方法:以大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E为研究对象,建立H/R模型。实验分为正常对照组和H/R组,H/R组分为缺氧4,8,12h及缺氧后复氧1,6,12和24h组。①细胞计数及计算细胞存活率(台盼蓝排斥试验);②检测培养基中LDH含量;③RT-PCR检测Caspase-12mRNA的表达。结果:①活细胞计数和细胞存活率随着缺氧时间的延长逐渐降低,至缺氧12h时达最低值,细胞复氧后活细胞计数和细胞存活率进一步减少,于H12/R12时达到最低值。②H/R组细胞培养基中LDH含量随着缺氧时间的延长而明显高于相应正常对照组,且在缺氧12h时达到最高峰。复氧后LDH含量逐渐上升,至H12/R12时升至最高值。③H4/R6时Caspase-12mRNA表达开始明显升高,于H8/R12时相点升高最为显著,至缺氧12h时又有所降低,但仍显著高于正常对照组。结论:经过缺氧8h复氧12h操作,得到了一个较理想的肾小管上皮细胞H/R模型。第二部分:牛磺酸对肾小管上皮细胞H/R的保护作用及其机制。目的:探讨牛磺酸对肾小管上皮细胞H/R的保护作用及其具体作用机制。方法:以NRK-52E为研究对象,实验分为正常对照组、H/R组和H/R+Tau组。H/R时间选择Caspase-12mRNA表达最高时的时间点H8/R12。H/R+Tau组:于培养基中加入牛磺酸液(终浓度为10、20、40、80mmol/L),余操作同H/R组。①细胞计数及计算细胞存活率(台盼蓝排斥试验);②流式细胞仪检测肾小管上皮细胞胞内游离Ca2+荧光强度和细胞凋亡率;③RT-PCR检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3的mRNA表达。④Western-blotting检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3的蛋白表达。结果:①各浓度牛磺酸处理组活细胞计数及细胞存活率明显高于H/R组。②NRK-52E细胞H/R后平均胞内游离Ca2+荧光强度值(反映细胞内游离Ca2+浓度)明显升高,与H/R组相比,牛磺酸处理后平均胞内游离Ca2+荧光强度值下降显著。H/R组凋亡率显著升高,各浓度牛磺酸处理组凋亡率与H/R组相比有显著性下降且有一定的剂量依赖性。③H/R组GRP78、Caspase-12、Caspase-3的mRNA和蛋白表达与正常对照组相比均显著增高,各浓度牛磺酸处理组与H/R组相比有显著性下降,且呈现一定的剂量依赖性。结论:牛磺酸对肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用,其机制主要是通过缓解胞浆钙超载并对葡萄糖调节蛋白GRP78和细胞凋亡相关基因Caspase-12、Caspase-3的表达有着不同程度的下调作用。第三部分:牛磺酸对大鼠急性RIRI的保护作用及其机制。目的:探讨牛磺酸对大鼠急性RIRI的保护作用及其具体作用机制。方法:以SD大鼠为研究对象,实验动物随机分为假手术组(Sham组)、I/R组和I/R+Tau组。夹闭双侧肾蒂45min再灌注24h制备急性RIRI动物模型。I/R+Tau组:在手术前3h按400mg/kg腹腔注射Tau液,余操作同I/R组。①检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr);②电镜观察肾小管上皮细胞超微结构改变;③HE染色观察肾小管组织学变化;④RT-PCR检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3的mRNA表达。⑤免疫组化检测GRP78、Caspase-12、Caspase-3的蛋白表达。结果:①缺血再灌注损伤能够明显降低肾功能,I/R组血BUN,Cr水平显著增高。与I/R组比较,I/R+Tau组血BUN,Cr水平显著下降。②通过HE染色及电镜观察发现缺血再灌注后肾组织严重损伤,而牛磺酸给药组损伤显著减轻。③I/R组GRP78、Caspase-12、Caspase-3的mRNA和蛋白表达与Sham组相比均显著增高,I/R+Tau组与I/R组相比有显著性下降。结论:牛磺酸对大鼠缺血再灌注后内质网应激介导的肾缺血再灌注损伤具有较好的保护作用。其分子机制主要是通过下调葡萄糖调节蛋白GRP78及内质网相关性死亡途径中Caspase-12的表达及活性等。综合以上所有实验结果得出结论:内质网应激参与了肾缺血再灌注损伤。牛磺酸对大鼠肾缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,其机制主要是通过缓解胞浆钙超载,下调葡萄糖调节蛋白GRP78和细胞凋亡相关基因Caspase-12、Caspase-3的表达及其活性等。