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目的:探究酒精对人肝L02细胞的损伤作用及Nrf2在酒精致肝细胞损伤过程中的作用机制。方法:用RNA干扰的方法下调L02细胞内Nrf2的表达,用于转染L02细胞的Nrf2-si RNA序列是,sense:5’-CCAGAACACUCAGUGGAAUTT-3’;antisense:5’-AUUCCACUGAGUGUUCUGGTT-3’。用RT-PCR法检测L02细胞内Nrf2在m RNA水平的表达,Western blot法检测L02细胞内Nrf2在蛋白水平的表达。MTT法检测L02细胞生存率的变化。比色法检测L02细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。羟胺法检测L02细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性。DCFH-DA染色荧光显微镜观察L02细胞内活性氧(ROS)的含量和分布,DCFH-DA染色流式细胞仪定量测定L02细胞内ROS的含量。DAPI染色荧光显微镜观察L02细胞核形态的改变并由此判断细胞凋亡的变化。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测L02细胞的凋亡率。结果:1.用不同浓度酒精处理L02细胞24 h,MTT法测定细胞生存率。结果显示,与0mmol/L酒精组相比,100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和800 mmol/L酒精组的细胞生存率分别是72.30%、53.14%、40.79%和34.67%。随着酒精浓度的增加,L02细胞生存率显著下降(P<0.01)。2.分别用100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L浓度的酒精处理L02细胞3 h,Western blot法分别检测细胞质和细胞核Nrf2蛋白的表达量。结果显示,与0 mmol/L酒精组相比,随着酒精浓度的增加,细胞质内Nrf2蛋白的表达量减少,细胞核内Nrf2蛋白的表达量增多。表明酒精具有促进细胞内Nrf2蛋白核转移的作用。3.构建Nrf2-si RNA表达载体,RT-PCR检测显示L02细胞内Nrf2 m RNA明显下调,Western blot检测显示L02细胞内Nrf2蛋白质表达量明显下调,表明本实验Nrf2-si RNA可有效抑制Nrf2表达。4.将Nrf2-si RNA转染L02细胞48 h,用相应浓度的酒精处理细胞24 h,测定细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果显示,0 mmol/L酒精组、200 mmol/L酒精组、0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组和200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的酶活性分别为1931.14 U、3569.90 U、1908.62 U和2809.61 U。与0 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精组细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性明显升高(P<0.01)。与200 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低(P<0.01)。0 mmol/L酒精组与0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组相比,细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性无明显差别(P>0.05)。测定细胞超氧化物歧化酶活性结果显示,0 mmol/L酒精组、200 mmol/L酒精组、0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组和200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的酶活性分别为117.83 u/mg prot、195.26 u/mg prot、112.60 u/mg prot和162.05 u/mg prot。与0 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精组细胞超氧化物歧化酶活性明显升高(P<0.01)。与200mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组细胞超氧化物歧化酶活性降低(P<0.01)。0 mmol/L酒精组和0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组相比,细胞超氧化物歧化酶活性无明显差别(P>0.05)。5.将Nrf2-si RNA转染L02细胞48 h,用相应浓度的酒精处理细胞24 h,DCFH-DA染色荧光显微镜观察细胞内ROS的变化,荧光强度与ROS水平呈正相关。结果显示,与0 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精组荧光强度增强,说明细胞内ROS水平增加。与200 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组细胞内ROS含量明显增多。与0 mmol/L酒精组相比,0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组ROS含量无明显变化。用流式细胞仪定量检测细胞ROS的变化。结果显示,0 mmol/L酒精组、200 mmol/L酒精组、0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组和200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的荧光强度分别为102.50%、131.16%、104.43%、157.86%。与0 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精组的ROS含量明显升高(P<0.01)。与200 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组ROS含量明显增多(P<0.01)。与0 mmol/L酒精组相比,0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组ROS含量无明显变化(P>0.05)。6.将Nrf2-si RNA转染L02细胞48 h,用相应浓度的酒精处理细胞24 h,用MTT法检测细胞的生存率。结果显示,与0 mmol/L酒精组比较,0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组细胞生存率达97.20%,二者比较无显著性差异(P>0.05);200 mmol/L酒精组的细胞生存率是57.31%,显著低于0 mmol/L酒精组(P<0.01);200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的细胞生存率是48.10%,也显著低于0 mmol/L酒精组(P<0.01)。200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的细胞生存率低于200mmol/L酒精组,二者比较有显著性差异(P<0.01)。7.将Nrf2-si RNA转染L02细胞48 h,用相应浓度的酒精处理细胞24 h,DAPI染色荧光显微镜观察L02细胞核形态的改变。结果显示,与0 mmol/L酒精组相比,0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组无明显变化;200 mmol/L酒精组和200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组有染色质凝集、固缩等凋亡现象;与200 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的染色质凝集等凋亡特征更加明显。采用Annexin V-FITC/PI双染法,流式细胞术检测L02细胞的凋亡率,结果显示,0 mmol/L酒精组、200 mmol/L酒精组、0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组和200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组的凋亡率分别为2.29%、17.17%、3.15%、30.04%。与0 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精组细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。与200 mmol/L酒精组相比,200 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。0 mmol/L酒精组和0 mmol/L酒精+Nrf2-si RNA组相比,细胞凋亡率无明显差别(P>0.05)。结论:1.酒精作用于肝L02细胞时,细胞Nrf2表达量增加并发生明显的核转位,转录调控活性增强,显著提高其靶向调控的抗氧化酶的活性,降低细胞内ROS的含量。2.酒精致肝L02细胞氧化损伤过程中,Nrf2蛋白对细胞具有保护作用,使细胞生存率升高,凋亡率降低。