研究背景：　　 造血系统在胚胎发生、器官形成、机体防御以及组织修复等生命活动过程中发挥着至关重要的作用,脊椎动物的造血大致分为原始造血和定向造血两个阶段,其典型特点是腹侧中胚层的多功能干细胞,经一系列诱导、增殖和分化之后,发育成成熟的各血细胞谱系。髓系造血是整个造血过程的重要组成部分,髓系细胞主要分为多核细胞系和单核细胞系两大类,多核吞噬细胞主要由中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞组成,在病原体入侵和组织损害时发挥着重要的免疫防御作用；单核吞噬细胞系统由循环中的巨噬细胞、枝状细胞、和组织定居细胞(骨组织中的破骨细胞,脑中的小胶质细胞,肝脏中的Kupffer细胞)组成,不仅在免疫应答中发挥着重要作用,而且参与器官形成和组织修复。髓系细胞的起源、增殖、迁徙和分化受到多种转录因子、生长因子及其受体的严格调控,癌症发生、免疫失调和神经功能紊乱与髓系细胞发育失调关系密切,所以对造血过程各阶段调控机制的明确有着重要的意义。由于造血系统的发育大多在胚胎时期完成,传统模式生物小鼠的胚胎子宫内发育给早期造血阶段的研究带来不便。新型模式生物斑马鱼可成为研究造血系统发育的最佳模式生物,首先作为脊椎动物,它与人类有较高的同源性,同时调节造血系统的分子通路是相当保守的；其次它的胚胎体外发育且透明,便于进行试验研究。　　 斑马鱼的造血过程与哺乳动物极为相似,在原始造血阶段,髓系前体细胞起源于前侧中胚层(ALM)的喙周血岛(RBI),在3-5个体节时在RBI区域可检测到髓系特异性转录因子pu.l的表达,在11-15个体节时,巨噬细胞前体细胞向头部正中线迁徙,在眼睛和心周形成局部聚集的细胞团块,继而逆向运动,横向迁徙,分散成单个细胞穿过卵黄囊,最终通过居维叶氏管(胚胎期开口于心耳的两个短的静脉)进入血液循环,在受精后26小时(26hpf)后可检测到功能性巨噬细胞；斑马鱼的粒细胞主要是嗜中性粒细胞,主要来自于中央细胞团块(ICM)靠尾部的区域,RBI区域也可形成,受精后48小时(48hpf)在血液循环系统和疏松结缔组织均可检测到功能成熟的中性粒细胞。原始红系与髓系分化平行,产生于ICM区域。定向造血与26-48hpf开始于背主动脉腹侧壁(VDA),相当于哺乳动物主动脉-性腺-中肾(AGM)区域,受精后3天(3dpf)尾部造血组织(CHT)成为过渡性造血器官,相当于哺乳动物的胎肝,最终于5dpf在肾脏建立永久造血器官,相当于哺乳动物的骨髓。定向造血阶段主要产生造血干细胞,造血干细胞再进一步分化成熟为各血细胞谱系。　　 再者,斑马鱼还具有体积小,生长周期短,繁殖能力强等优点,非常适合化学诱变大规模正向遗传学筛选,可分离突变基因组,找到造血系统功能单一的基因缺陷突变体。本研究采用经典的N-乙基-亚硝基脲(N-ethylN-nitrosourea,ENU)化学诱变,收集F3代胚胎,进行中性红和苏丹黑B细胞化学染色,可筛选髓系细胞异常的突变体,通过对已得突变体的进一步研究,有望了解原始造血阶段髓系细胞的起源、增殖、迁徙、分化的具体过程以及调控机制。　　 本研究由三个部分组成:第一部分 N-乙基-亚硝基脲(N—ethylN-nitrosourea,ENU)化学诱变及正向遗传学筛选；第二部分斑马鱼原始造血巨噬细胞突变体1276的表型鉴定及性状分析；第三部分斑马鱼原始造血中性粒细胞突变体1038的表型鉴定及性状分析。　　 第一部分ENU化学诱变及正向遗传学筛选　　 1.目的：　　 利用化学诱变剂ENU饱和诱变AB野生型斑马鱼基因组,然后对突变基因组进行正向遗传学筛选,筛选斑马鱼原始造血髓系细胞突变体。　　 2.方法　　 利用化学诱变剂ENU诱变野生型AB斑马鱼雄鱼的精原细胞,突变基因组保留传代,采用中性红染液和苏丹黑B染液对F3代的胚胎进行细胞化学染色,筛选原始造血髓系细胞突变体。　　 3.结果　　 成功筛选1800个F2家族,2952个突变基因组,发现中性红染色信号异常突变体10个,苏丹黑B染色信号异常突变体26个,两者均异常的突变体2个。　　 4结论　　 ENU化学诱变试验设计合理,细胞化学染色方法是一种简单、高效、易行的筛选方法。　　 第二部分斑马鱼原始造血巨噬细胞突变体1276的表型鉴定及性状分析　　 1.目的　　 对斑马鱼原始造血巨噬细胞突变体1276进行表型鉴定及性状分析　　 2.方法　　 采用中性红和苏丹黑B细胞化学染色方法对髓系细胞进行功能学评估,通过检测不同谱系血细胞标记基因(apoe、l-plastin、lyc、βel、ragl、c-myb)在不同发育阶段的mRNA及蛋白的表达水平,来界定巨噬细胞在来源、增殖、迁徙、组织定居哪一过程存在异常。　　 3.结果　　 突变体1276在原始造血阶段,中性红染色全身信号缺失,小胶质细胞标记基因apoe表达缺失,巨噬细胞标记基因l-plastin,头部表达减少,背主动脉壁腹侧(VDA)区域表达正常,粒细胞、红细胞均未见异常;在定向造血阶段,巨噬细胞仍存在异常,但粒细胞、红细胞、淋巴细胞以及造血干细胞均未见明显异常。　　 4.结论　　 突变体1276在原始造血阶段,巨噬细胞存在功能障碍,以及不同程度发育及迁徙异常；在定向造血阶段这一性状并未得到代偿。　　 第三部分斑马鱼原始造血中性粒细胞突变体1038的表型鉴定及性状分析　　 1.目的　　 对斑马鱼原始造血中性粒细胞突变体1038进行表型鉴定和性状分析　　 2.方法　　 采用苏丹黑B和中性红细胞化学染色方法对髓系细胞进行功能学评估,通过检测不同谱系血细胞标记基因(mpo、lyc、βel、ragl、c-myb)在不同发育阶段的mRNA的表达水平,来界定中性粒细胞在来源、增殖、迁徙、功能成熟哪一过程存在异常。　　 3.结果　　 突变体1038在原始造血阶段和永久造血阶段,苏丹黑B染色都是全身未见信号阳性细胞,2 dpf和5 dpf的中性粒细胞标记基因mpo的表达均明显减少,而另一个中性粒细胞标记基因lyc表达正常且中性红染色可见阳性细胞,其他细胞谱系也未见明显异常。　　 4.结论　　 突变体1038在原始造血阶段和永久造血阶段,髓系的来源正常,且髓系前体细胞可成功分化形成中性粒细胞和巨噬细胞,但中性粒细胞在成熟的过程中出现异常,初步证实mpo上游调控通路存在异常,不能发育成功能成熟的中性粒细胞。