论文部分内容阅读
中长期空间飞行导致机体发生的骨丢失等航天医学问题,已经成为人类向更深、更远、更高的外层空间探索的制约因素之一。目前空间飞行采取的运动锻炼、药物预防和营养补充都不能有效防止骨丢失的发生发展;为了确保航天员在未来长期飞行任务中健康、高效工作,需要在细胞分子水平阐明空间骨丢失的发生机制;发展基于细胞分子本质认识的有效对抗防护措施。这是载人航天发展的迫切和必然要求。空间骨丢失是航天员在太空易患疾病的首要风险因素,其发生的主要原因是骨形成减少。失重不但影响成骨细胞的分化进程,还影响其分化起始。启动和调控成骨细胞分化的关键转录因子Cbfa1,也是一个力信号传导的靶分子。骨相关细胞因子参与了成骨细胞的增殖、分化调节,包括对Cbfa1活性的调节。失重影响多个骨相关细胞因子的表达和信号传导。因此,阐明失重条件下骨相关细胞因子在骨丢失中的作用,对骨丢失机制的阐明和发展有效对抗防护措施具有重要意义。前期研究表明失重条件下,骨相关细胞因子对BMSC和前成骨细胞的增殖、分化的促进作用减弱,使成骨细胞数量减少和活性下降,导致骨形成减弱,进而发生骨质丢失。因此,本研究构建了能用报告基因反映Cbfa1活性的成骨细胞模型和IGF-I选择性剪接模型;采用细胞回转、大鼠尾吊和液流剪切等力刺激模型;研究骨相关细胞因子对BMSC增殖、对前成骨细胞Cbfa1活性的影响及可能的机制,观察尾吊大鼠骨骼组织中IGF-I基因表达和调控变化;旨在探讨骨相关细胞因子在失重条件下表达、调控和作用的变化,为阐明空间骨丢失的细胞分子机制提供科学依据。实验方法:(1)采用基于红细胞裂解的全骨髓培养法分离培养BMSC,通过亚甲基蓝染色和流式细胞仪检测,观察回转对BMSC增殖、细胞周期及对细胞因子促增值效应的影响;采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western、基因芯片方法,研究回转对BMSC微丝骨架、ERK1/2活性、成骨向分化、基因表达谱的影响。(2)通过载体构建和稳定转染,构建用报告基因反映成骨细胞Cbfa1活性的模型,通过EGFP的荧光强度半定量分析或Luc酶活性分析,研究不同重力、VD3和BMP2对Cbfa1活性的影响以及回转条件下Cbfa1对VD3和BMP2的响应特征;通过双向CO-IP,观察回转和超重条件下VDR与Cbfa1相互作用的变化;采用微丝骨架破坏剂CB和稳定剂JAS,研究细胞微丝骨架在BMP2诱导Cbfa1活性中的作用。(3)利用细胞回转和大鼠尾吊模型,采用RT-qPCR方法,研究回转和不同尾吊时间对成骨细胞、骨骼组织IGF-I选择性剪接异构体表达的影响;通过PCR扩增和基因亚克隆,构建了4个含IGF-I外显子5及两侧不同长度内含子的选择性剪接载体,分别稳定转染到MC3T3-E1中,建立IGF-I选择性剪接模型;利用流体剪切实验系统;观察1Pa剪切力刺激1小时对IGF-I选择性剪接的影响。结果发现:(1)回转破坏细胞微丝骨架,并具有时间依赖性;使G1/G0期的细胞数量增加,由86.6%增加到91.4%,从而抑制了BMSC增殖;降低了信号分子ERK1/2活性和细胞因子IGF-I、EGF和bFGF对BMSC的促增殖作用,促增殖效应分别由15.5%、16.3%和26.9%下降到10.5%、10.3%和19.6%;抑制了BMSC的成骨向分化潜能;基因表达谱和功能聚类分析表明与细胞周期、微丝骨架、成骨细胞分化相关基因的表达发生了改变,且表达升高的负调控基因占多数。(2)建立了能用EGFP或Luc报告基因反映Cbfa1活性的成骨细胞模型;发现回转抑制Cbfa1活性,而超重能提高Cbfa1活性;VD3和BMP2均可提高Cbfa1的活性,但回转可降低VD3和BMP2对Cbfa1活性的刺激作用,回转条件下VD3和BMP2诱导的Cbfa1活性增加分别由79%和18%下降到43%和14%,同时VD3受体VDR与Cbfa1之间的相互作用受到抑制;回转可破坏MG63的微丝骨架;低浓度微丝骨架破坏剂CB(0.5nmol/L)降低了BMP2对Cbfa1活性的增强作用,而微丝骨架稳定剂JAS在一定程度上能保护BMP2对Cbfa1活性的刺激作用。(3)大鼠尾吊降低骨骼组织IGF-IEa和MGF的表达,且具有时间依赖性;使血清中IGF-I水平下降。筛选出了4个分别稳定转染含外显子5及两侧不同长度内含子的IGF-I选择性剪接载体的细胞株;1Pa流体力能显著提高稳定转染p5341选择性剪接载体细胞株的MGF-EGFP表达,而对其他细胞株没有影响。结论:回转抑制了BMSC的增殖和骨向分化潜能,降低其对细胞因子IGF-I、EGF和bFGF的响应性。回转通过削弱VDR与Cbfa1之间的相互作用,降低了VD3对Cbfa1活性的刺激作用;细胞微丝骨架参与BMP2对Cbfa1活性的刺激作用,而回转诱导的微丝骨架解聚可能是Cbfa1对BMP2的响应性下降的重要原因;大鼠尾吊导致骨骼组织IGF-IEa和MGF表达下降和血清IGF-I水平降低;失重可以影响IGF-I选择性剪接。剪切力可通过IGF-I内含子上的元件调控其选择性剪接。这些研究为阐明空间骨丢失的细胞分子机制提供重要的科学依据。