犁头尖凝集素(Typhonium divaricatum(L.) Decne agglutinin)的纯化、性质研究、分子克隆及表达

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天南星科植物犁头尖是我国传统中药,其根状茎中含有一种凝集素,命为犁头尖凝集素(Typhonium divaricatum(L.)Decne agglutinin,TDA)。利用层析等方法分离得到TDA蛋白纯品。性质研究发现TDA具强的兔血细胞凝集素活性,在浓度为0.95 μg/ml时仍能凝集兔红细胞;分子量为48 KD;等电聚焦结果显示,TDA的等电点大约为4.5和6.5,表明TDA是由两个不同亚基组成的四聚体。糖抑制实验结果显示甘露聚糖肽,卵粘蛋白,去唾液酸糖蛋白和猪甲状腺球蛋白对TDA的凝血活性有很强的抑制作用,表明TDA是甘露糖特异性结合蛋白质。 研究不同温度和pH对TDA的兔红细胞凝集活性的影响,结果表明TDA是一种对热,对酸碱相对稳定的蛋白质。TDA对金属离子也不依赖。 采用荧光淬灭方法研究TDA蛋白质溶液的构象,表明不带电荷的极性淬灭剂丙烯酰胺能淬灭100%的色氨酸的荧光,阴离子淬灭剂KI和阳离子淬灭剂CsCl则分别淬灭了83.3%和50%的荧光,说明TDA分子中的色氨酸大部分都位于分子表面,小部分埋藏于分子内部疏水环境中,这与荧光光谱的结果是一致的。 用荧光光谱法研究了脲、盐酸胍和SDS三种变性剂在不同浓度下构象的变化和凝血活性的变化情况。研究发现三种变性剂均导致TDA结构的改变破坏活性中心,使得凝血活性下降,甚至丧失。 采用基团特异性化学修饰剂对TDA的特定氨基酸残基进行修饰,结合其凝血活性的变化,并通过荧光光谱学手段研究TDA分子构象的变化。研究发现色
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