论文部分内容阅读
目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是最常见的传染性病原菌之全球有超过50%的人群感染。H.pylori感染不但是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,而且与胃黏膜相关性淋巴瘤及胃腺癌的发生密切相关。世界卫生组织已将H.pylori列为第一类致癌因子。抗生素为目前治疗H.pylori感染的主要药物,但随其广泛应用,H.pylori耐药问题及胃肠道菌群失调不良反应日趋严重。因此,研发新一代安全、高效、高选择性的抗H.pylori药物具有重要意义。在对南药广藿香的研究中发现：(1)主要成分广藿香醇能显著抑制小鼠H.pylori感染胃炎的炎症反应,减少H.pylori载荷量；(2)高选择性抑制H. pylori及其特异代谢酶——脲酶,而不影响肠道正常菌群的生长。脲酶不仅是H. pylori区别于其它胃肠道微生物的主要特征,而且是H.pylori在胃部生存的关键酶,对其致病起决定作用。本研究以脲酶为切入点,应用酶学方法研究广藿香醇抑制H. pylori脲酶的机理,并通过H.pylori脲酶体外诱导胃黏膜上皮细胞GES-1损伤模型和急性胃溃疡动物模型的建立,探讨广藿香醇治疗H. pylori相关性胃炎的机理。方法：1.广藿香醇对H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究以H. pylori脲酶和洋刀豆(Jack bean)脲酶为研究载体,通过脲酶活性抑制试验、抑制类型分析、动力学研究、抑制位点分析、分子对接研究,探讨广藿香醇特异性抗H. pylori及其脲酶的机理。2.广藿香醇对H. pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1损伤的保护作用通过H. pylori脲酶体外诱导GES-1细胞损伤模型的建立,模拟H. pylori侵染胃黏膜特征,考察广藿香醇对脲酶致GES-1损伤的影响；进行相关炎症介质,氧化水平及凋亡分析,从炎症、氧化应激及细胞凋亡角度阐述广藿香醇治疗H. pylori相关性胃炎的作用机理。3.广藿香醇对急性胃黏膜损伤的保护作用研究分别采用无水乙醇,吲哚美辛,幽门结扎及水浸应激四种诱导方法,建立大鼠急性胃溃疡模型,考察对溃疡面积和溃疡指数的影响,分析相关模型炎性介质,氧化水平,胃黏膜血流量(GMBF)和胃黏液量,评价广藿香醇对胃黏膜的保护作用及机理。结果：1.广藿香醇对H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究(1)对脲酶活性抑制作用研究结果显示,广藿香醇抑制H. pylori和Jack bean脲酶的半数抑制浓度(IC50)分别为2.67±0.798mM和2.993±0.411mM,阳性对照乙酰氧肟酸(AHA)抑制H. pylori和Jack bean脲酶的IC50分别为0.585±0.242mM和0.379±0.256mM。抑制作用虽不及AHA,但半数抑制浓度仍达至毫摩尔级别。(2)抑制类型分析H.pylori和Jack bean脲酶酶促反应米氏常数KM分别为1.47±0.12mM和11.12±0.12mM,最大反应速度Vmax分别为0.85±0.11mM/min和0.50±0.11mM/min。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,得到广藿香醇抑制H. pylori脲酶的动力学参数的变化特点：KM不变,vmax降低,属非竞争性抑制类型;Jack bean脲酶KM减少,vmax降低,属反竞争性抑制。(3)动力学研究根据广藿香醇与脲酶的反应进度曲线,反应速率常数vo,vs和kapp分别为1.6×10-1mM/min,1.6×10-2mM/min和1.1min-1,脲酶反应过程中呈现浓度依赖性。(4)抑制位点分析广藿香醇对脲酶的作用位点可能是巯基,同时对Ni2+亦有一定影响；对H.pylori和Jack bean脲酶的抑制作用具有不可逆性,加入DTT不可恢复两者活性。(5)分子对接研究分子对接研究显示,广藿香醇作用H.pylori脲酶活性中心,通过羟基螯合活性腔底部Ni2+,并以氢键结合活性中心关键氨基酸残基,影响脲酶活性构象。广藿香醇对H. pylori脲酶亲和力优于Jack bean脲酶,与上述抑酶作用及位点分析较为一致。2.广藿香醇对H. pylori脲酶诱导胃上皮细胞GES-1损伤的保护作用MTT和LDH试验显示,广藿香醇(5,10,20μM)对H.pylori脲酶致GES-1细胞存活率下降具有抑制作用；有效降低H. pylori脲酶诱导GES-1致炎因子释放(IL-2, IL-4, NO和TNF-a),提高抗炎因子水平(IL-13),从而减轻炎症损伤。／AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术结果显示,广藿香醇能有效抑制H. pylori脲酶致GES-1细胞凋亡；与Hoechst染色结果一致,广藿香醇干预后可减少核固缩与碎裂、凋亡小体出现；抑制脲酶致GES-1线粒体膜电位MMP下降,降低ROS产生；显著提高SOD和CAT活性,降低MDA含量。上述结果提示,广藿香醇对H.pylori脲酶所致GES-1损伤的保护作用可能与降低细胞炎症水平,减轻氧化损伤及抑制凋亡有关。3.广藿香醇对急性胃黏膜损伤的保护作用研究广藿香醇(10,20和40mg/kg)口服给药能有效对抗无水乙醇及吲哚美辛所致大鼠胃黏膜损伤,降低溃疡面积和溃疡指数,改善病理形态及炎症性反应；降低无水乙醇致胃黏膜损伤大鼠血清TNF-a和IL-6含量,提高IL-10水平；提高胃黏膜损伤大鼠胃组织CAT和GSH水平,降低MDA含量；提高胃溃疡大鼠胃组织中NP-SH和PGE2含量；上调吲哚美辛致胃溃疡大鼠胃组织COX-1和COX-2的mRNA表达；提高应激性溃疡大鼠GMBF,改善胃黏膜损伤；提高幽门结扎大鼠胃黏液含量。由此,广藿香醇胃黏膜保护作用可能与改善炎症反应,调节氧化系统平衡,提高PGE2水平和胃黏液含量,改善GMBF,增加胃黏膜防御功能有关。结论：1.广藿香醇对菌源性和植物源性脲酶的抑制作用较相似,然而其抑制方式存在一定差异；广藿香醇对H.pylori脲酶亲和性高于Jack bean脲酶,可能与其特异性抗H.pylori有关,初步推断广藿香醇抑制脲酶的位点为活性中心及其附近氨基酸残基。2.建立H.pylori脲酶感染人胃上皮GES-1细胞模型,验证了广藿香醇对H.pylori脲酶所致GES-1损伤的保护作用；机制可能与降低细胞炎症反应,减轻氧化损伤及抑制凋亡有关。3.验证广藿香醇对急性胃溃疡的保护作用,揭示其机制可能与改善炎症反应,调节氧化系统平衡,提高PGE2水平和胃黏液含量,改善GMBF,增加胃黏膜防御功能有关。体内外胃黏膜保护作用均与炎症、氧化应激相关。综上,广藿香醇治疗H.pylori相关性胃炎的机制可能包括：(1)抑制脲酶活性,减少H.pylori在体内的定植及造成的胃黏膜损伤；(2)改善炎症反应,减轻氧化损伤,增加胃黏膜防御功能。研究成果有助阐明广藿香治疗消化系统疾患的药效物质及作用机理,为新型脲酶抑制剂及抗H.pylori相关性胃炎药物研发提供基源于中药的一类新的先导化合物。