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MicroRNAs(miRNAs)是18-22个核苷酸组成的单链RNA小分子,通过碱基互补配对原理,与靶基因mRNA的3 ’UTR或5’UTR区域结合,干扰mRNA的翻译,或者直接降解mRNA,起到抑制mRNA功能的作用。目前已有很多文献报道miRNAs参与调节肿瘤的发生与进展。唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)来源于唾液腺上皮的分泌细胞,是一种比较常见的唾液腺恶性肿瘤。腺样囊性癌具有以下几个主要的生物学特征:生长相对缓慢、侵袭性强、易沿神经扩散、易局部复发及沿血道远处转移到肺等器官、化疗和放疗效果不佳和长期预后较差等。近期的研究已经揭示miR-101-3p对于不同种类肿瘤的调节作用。例如,miR-101-3p的抑癌作用已在多种肿瘤中被发现,但具体作用机制并未完全阐明。有研究报道,miR-101-3p在胃癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌和肝癌等肿瘤中低表达,miR-101-3p可以通过促进上述肿瘤细胞凋亡,或者抑制细胞增殖和转移来发挥抑癌作用。在本研究中,我们在SACC组织和SACC细胞系中均检测到miR-101-3p表达下调。过表达miR-101-3p后,发现SACC细胞的侵袭、增殖、克隆形成和裸鼠移植瘤的形成受到了明显抑制,SACC细胞凋亡也明显增加。我们发现 miR-101-3p 靶向原癌基因 Pim-1(Moloney murine leukemia virus 1),miR-101-3p对SACC-83和SACC-LM细胞的增殖和侵袭抑制作用可以被Pim-1过表达挽救。miR-101-3p不仅下调了 survivin,cyclinD1和β-catenin的蛋白水平,并且增强了 SACC-83和SACC-LM细胞细胞对顺铂的药物敏感性。总之,实验结果揭示了 miR-101-3p/Pim-1在SACC的发生和发展过程中的部分作用机制,并可能为SACC的治疗提供新的思路。本研究主要包括以下三个实验内容:实验一 miR-101-3p在唾液腺腺样囊性癌中的表达及作用的体内外研究目的:检测人类唾液腺腺样囊性癌标本和正常腮腺组织标本、唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83和SACC-LM中miR-1 01-3p的表达。上调或抑制miR-101-3p表达后,并通过体内体外实验观察miR-101-3p对SACC细胞功能的影响。方法:用real-time PCR检测30个人类唾液腺腺样囊性癌标本和10个人类正常腮腺标本中的miR-101-3p表达,以及人唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83和其恶性程度更高的细胞亚系SACC-LM中的miR-101-3p表达,将两组数据进行比较分析。通过慢病毒、miR-101-3p mimics和miR-101-3p inhibitor构建miR-101-3p过表达或沉默的SACC细胞系,进行细胞侵袭、细胞凋亡、克隆形成、细胞增殖和裸鼠移植瘤实验,观察miR-101-3p过表达或沉默对SACC细胞功能的影响。结果:SACC中的miR-101-3p的表达相较于正常腮腺组织明显下调,恶性程度高的SACC细胞系SACC-LM中的miR-101-3p表达也明显低于恶性程度低的SACC-83。肿瘤细胞侵袭实验结果显示,在SACC-83和SACC-LM细胞中过表达miR-101-3p后,SACC-LM和SACC-83细胞的侵袭能力较对照组明显降低;抑制miR-101-3p的表达后,细胞的侵袭能力增强。同时,miR-101-3p过表达组的SACC-LM和SACC-83细胞凋亡增多。过表达miR-101-3p后,SACC-LM和SACC-83的细胞克隆形成受到了明显抑制。CCK-8细胞增殖实验表明,miR-101-3p过表达明显抑制了 SACC-LM和SACC-83的细胞增殖能力,而抑制miR-101-3p表达可以明显增强了细胞增殖能力。在裸鼠移植瘤实验中,miR-101-3p过表达组裸鼠移植瘤的肿瘤生长、体积和质量均明显低于对照组。免疫组织化学染色发现,在miR-101-3p过表达的SACC-LM裸鼠移植瘤中,Ki67表达明显低于对照组。通过Western blot检测到miR-101-3p上调组的Pim-1,survivin,cyclinD1和β-catenin的蛋白水平都显著低于对照组裸鼠移植瘤。结论:miR-101-3p在人类唾液腺腺样囊性癌中的表达低于正常腮腺组织,在恶性程度更高的SACC-LM细胞中的表达低于SACC-83细胞;miR-101-3p抑制SACC-LM和SACC-83的细胞增殖、侵袭、克隆形成,并且增加SACC-LM和SACC-83细胞凋亡;miR-101-3p抑制裸鼠体内SACC-LM移植瘤的生长;上调 miR-101-3p 后,裸鼠移植瘤内的 Ki67,Pim-1,survivin,cyclinD1 和 β-catenin的表达受到抑制。实验二miR-101-3p通过靶向Pim-1发挥抑制SACC细胞增殖、侵袭作用的机制研究目的:寻找miR-101-3p的靶基因,研究miR-101-3p通过抑制何种靶基因来发挥其影响SACC细胞功能的作用机制。方法:通过TargetScan和miRanda生物信息学软件,检索miR-101-3p的靶基因,经过比对和综合分析,最后选择了原癌基因Pim-1(莫罗尼鼠白血病病毒前病毒整合基因-1,proviral integration of moloney murine leukemia virus)作为研究对象。用real-time PCR检测Pim-1在SACC组织和正常腮腺组织中的表达,并将Pim-1与miR-101-3p在SACC组织中的表达进行相关性分析,研究二者是否存在负相关。通过荧光素酶报告基因实验,确定Pim-1是否与miR-101-3p有靶向关系。Western blot 检测 Pim-1,survivin,cyclin D1 和β-catenin 在 SACC 细胞系中的表达。通过细胞侵袭实验和CCK-8细胞增殖实验研究Pim-1和miR-101-3p对SACC细胞侵袭和增殖的影响。结果:Pim-1在人类SACC组织中的表达相比于正常腮腺组织明显升高,与miR-101-3p在SACC组织中的表达进行相关性分析后,发现二者呈负相关。为了进一步探究miR-101-3p和Pim-1之间是否存在靶向关系,我们构建出Pim-1的野生型和突变型的荧光素酶报告基因质粒,实验结果证明Pim-1是miR-101-3p的靶基因。用 Western blot 检测转染了 miR-101-3p mimics 和 miR-101-3p inhibitor的 SACC-83 和 SACC-LM 细胞中的 survivin,cyclin D1,和 β-catenin 蛋白水平,结果与体内实验的结果类似,miR-101-3pmimics下调了 survivin,cyclinD1,和β-catenin 的表达,miR-101-3p inhibitor 上调了 survivin,cyclin D1和 β-catenin 的表达。用Pim-1的siRNA敲低SACC-83和SACC-LM细胞中Pim-1的表达,SACC-83和SACC-LM细胞增殖能力被明显抑制。降低miR-101-3p的表达后,被Pim-1 siRNA抑制的SACC-83和SACC-LM细胞增殖能力没有得到明显提高。通过慢病毒过表达Pim-1后,SACC-83和SACC-LM的细胞增殖能力明显增强,并且这种增强的细胞增殖能力不能被过表达miR-101-3p抑制。通过细胞侵袭实验,发现Pim-1的高表达可以显著增加SACC-83和SACC-LM细胞侵袭,并且挽救由miR-101-3p引起的细胞侵袭抑制。结论:Pim-1 是 miR-101-3p 的靶基因;miR-101-3p 抑制 SACC-83 和 SACC-LM细胞 survivin,cyclin D1和 β-catenin 的表达;miR-101-3p 通过靶向Pim-1 抑制SACC-83和SACC-LM细胞增殖和侵袭能力。实验三miR-101-3p增加SACC细胞对顺铂的药物敏感性目的:研究miR-101-3p对SACC细胞药物敏感性的影响方法:10 μM顺铂处理SACC-83和SACC-LM细胞24小时后,通过real-time PCR检测miR-101-3p的表达,Western blot检测Pim-1的表达。通过流式细胞仪和CCK-8检测miR-101-3p对于由顺铂引起的SACC-83和SACC-LM细胞凋亡和增殖抑制有何影响。结果:通过 real-time PCR 和 Western blot 检测了 SACC-83 和 SACC-LM 细胞的miR-101-3p和Pim-1的表达水平。用10μM顺铂处理SACC-83和SACC-LM细胞24小时后,通过real-time PCR检测SACC-83和SACC-LM细胞内miR-101-3p的表达水平,发现miR-101-3p表达明显下降,Western blot检测到Pim-1 表达明显上升。把转染了 miR-101-3p mimics 后的 SACC-83 和 SACC-LM细胞与对照组细胞一起用10 μM顺铂处理24小时后,通过流式细胞仪检测细胞凋亡。miR-101-3p高表达组的SACC-83和SACC-LM细胞凋亡明显增加,细胞的增殖能力明显受到抑制。这些实验结果表明miR-101-3p增加了 SACC细胞的对顺铂的药物敏感性。结论:miR-101-3p增强了顺铂诱导的SACC-83和SACC-LM细胞凋亡增加和细胞增殖抑制的作用。