[背景]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)特有的微血管并发症之一,其特征性的病理改变包括系膜区细胞外基质(extracellular matrix, ECM)堆积、肾小球硬化及小管间质纤维化,最终导致进行性尿蛋白/白蛋白排泄的增加和肾功能的下降。DN的发病机制复杂,目前认为高血糖、肾血流动力学的异常、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)的增多、多元醇及蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)途径的激活、氧化应激的产生等多种因素共同参与了DN的发生与发展。如何对糖尿病肾病进行有效地防治一直是临床关注的热点与难点。肾小球系膜细胞(mesangial cell, MC)是肾小球最重要的固有细胞之一,对维持肾小球毛细血管床的完整性与系膜基质代谢平衡起到了重要的作用。在DN的发病中,各种病理因素直接作用于MC,引起MC肥大与过度增殖,系膜区胶原纤维(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)等ECM成分异常的聚集沉积,构成了DN肾小球硬化重要的病理基础。持续的细胞外高糖,以及高糖介导的各种病理因素还可以通过肾小球内皮细胞、足细胞、炎症细胞与MC相互作用,产生细胞因子与炎症介质,通过“自分泌”、“旁分泌”等方式影响MC,介导并促进了肾小球纤维化向肾小球硬化的进展。在DN肾小球硬化的病理过程中,转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)是重要的肾脏致纤维化的标志之一。MC能够分泌TGFβ1,并具有高亲和力的TGFβ1受体。因而TGFβ1能够通过“自分泌”、“旁分泌”的方式发挥其促进肾脏纤维化的作用。细胞外高糖以及高糖介导的各种病理因素均可作为促纤维化因素作用于MC促进TGFβ1的合成与分泌,激活TGFβ1下游Smads信号转导分子家族,促进ECM的产生并抑制其降解。除了TGFβ1/Smads介导的DN肾纤维化经典途径外,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路可以独立的或与TGFβ1/Smads通路相互作用,参与DN的发病。MAPK通路主要包括细胞外信号调控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates, ERK)、c-Jun N端激酶(c-jun amino-terminal kinase, JNK)/应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)、p38MAPK等途径,是细胞将信号从细胞外传递到细胞内的主要通路。糖尿病高糖状态下,多元醇途径的激活、蛋白质非酶糖化,PKC途径的激活以及氧化应激水平的增加均可导致MAPK的激活,磷酸化下游转录因子,调节基因的表达,参与DN的发生发展。糖尿病肾病的病理状态下,在MC过度增殖、系膜区ECM异常增多的同时,还伴有多种细胞因子和炎症介质分泌的增加,导致局部炎症反应的激活,加速了肾小球硬化的过程和肾病的进展。糖尿病本身是一个慢性炎症的过程并由此引起巨噬细胞在多个组织中聚集。这种巨噬细胞的聚集与糖尿病疾病状态、炎症的激活及DN肾损伤的进展关系密切。大量研究表明,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)在糖尿病组织巨噬细胞浸润及炎症中起到了关键作用。MCP-1是一种能被多种细胞表达的,对单核细胞、T淋巴细胞等具有趋化作用的分泌型蛋白。MCP-1与其受体结合后,诱导下游黏附分子的表达,使单核细胞／巨噬细胞等向病变部位聚集而发挥其病理作用。高糖培养系膜细胞能够通过PKC与氧化应激的激活促进MCP-1的表达。阻断MCP-1与其受体结合能减少糖尿病小鼠肾组织巨噬细胞的浸润及TGFβ1、Ⅳ胶原的表达,有效地阻止DN肾小球硬化的进展。前列环素(prostacyclin, PGI2)是前列腺素(prostaglandin, PG)家族中的重要成员,主要由血管内皮细胞产生,具有强大的舒张血管平滑肌、扩张血管及抗血小板凝聚的作用。体内的细胞膜磷脂被磷脂酶A2水解为花生四烯酸,后者进一步在环氧合酶与前列环素合成酶的作用下逐步合成PGI2。PGI2合成后通过与两类受体结合发挥其生物学作用：1)与细胞膜上G蛋白偶联的膜受体IP结合,主要激活下游的环磷酸腺苷(cAMP)／蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)途径发挥舒张血管、抗血小板凝聚及抗纤维化等作用；2)与细胞核过氧化物酶体增殖激活受体β/δ (peroxisome proliferator-activated receptor β/δ, PPARβ/δ)结合,通过PPAR特异的反应元件PPRE (PPAR responsive element)调控靶基因的转录。PGI2的性质十分不稳定,37℃时半衰期仅4min,很快转化为稳定的无活性的代谢产物6-酮-前列腺素。目前主要通过与PGI2有相似药理作用的人工合成的各种PGI2类似物来研究PGI2的作用机制。贝前列素钠(beraprost sodium, BPS)将PGI2结构中的外烯醇醚结构替换为环戊烷苯并呋喃酮结构,体内半衰期延长至60min,口服途径给药仍保留了与PGI2相似的药理作用。体外研究表明,BPS通过增加系膜细胞内cAMP水平抑制机械迁张拉力对MAPK的激活从而抑制FN的表达,减轻肾小球内高压对MC的损伤作用；还能够抑制高糖诱导的MC的增殖、Ⅳ胶原的合成并提高MC的抗氧化能力。动物实验结果显示,BPS喂养OLETF大鼠后,其肾小球体积及硬化指数明显低于对照组,肾小球内AGEs的形成及巨噬细胞浸润明显减少,同时伴有尿蛋白排泄率及血清尿素氮的降低。在STZ诱导的DM大鼠中,BPS通过调节入球小动脉内皮细胞一氧化氮合酶活性抑制了DM状态下入球小动脉的扩张,减轻了肾小球的高滤过,同时还抑制了巨噬细胞的浸润。早期的临床研究发现,BPS能够抑制糖尿病患者血清血栓调节蛋白水平,通过减轻AngⅡ对出球小动脉的收缩作用、缓解肾小球的高滤过状态,降低糖尿病患者尿白蛋白的排泄。这些结果提示BPS具有一定的肾脏保护作用。因而,BPS作为一种可以口服的PGI2类似物,在糖尿病肾病的防治中具有广泛地应用前景,进一步研究BPS肾脏保护的作用机制,具有十分重要的临床意义。因此在本研究中,我们探讨了PGI2类似物贝前列素钠(BPS)对高糖环境下大鼠系膜细胞株HBZY-1细胞ECM合成与降解的作用,对趋化因子MCP-1表达的影响,以及对细胞内信号通路的影响,以阐明贝前列素钠对肾脏保护作用的可能机制,为贝前列素钠用于糖尿病肾病的临床防治提供部分理论依据。第一章贝前列素钠对高糖环境下大鼠系膜细胞ECM合成的影响[目的]1.观察不同浓度BPS对高糖环境下大鼠细胞系膜细胞株HBZY-1增殖活性的影响。2.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN及MMP-2蛋白质表达的影响。3.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN及MMP-2mRNA水平表达的影响。4.探讨p38MAPK、ERK信号通路是否参与了BPS对高糖环境下HBZY-1细胞ECM合成的调节。5.探讨BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1/Smad3信号通路的影响。[方法]1.细胞培养：采用含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、5%CO2培养箱内传代培养大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1。2.细胞处理分组：正常葡萄糖浓度组(NG组,葡萄糖浓度5.6mmol/L),高葡萄糖浓度组(HG组,葡萄糖浓度30mmol/L), HG联合不同浓度的BPS组：BPS药物处理浓度分别为0.1umol/L(uM),0.5uM,1uM,2uM,5uM,10uM。3.不同处理组(NG组,HG组,HG分别联合不同浓度的BPS组)体外培养HBZY-1细胞,于24h,48h用MTT法测定细胞增殖活性。4.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于24h,48h收集细胞培养上清液,用Elisa法测定细胞培养上清液中TGFβ1、FN及MMP-2蛋白质的表达量。5.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于24h收集细胞,用实时荧光定量(real-time) PCR法测定细胞TGFβ1、FN及MMP-2mRNA的相对表达量(2-△△Ct)。6.应用免疫印迹法分别检测Omin,15min,30min,60min,90min不同时间点HG培养条件下HBZY-1细胞p38MAPK、ERK磷酸化蛋白的表达。7.分别选取HG诱导HBZY-1细胞p38MAPK、ERK磷酸化蛋白表达最显著的时间点,应用免疫印迹法分别检测该时间点HG联合不同浓度BPS培养HBZY-1细胞p38MAPK、ERK磷酸化蛋白的表达。8.应用免疫印迹法分别检测Omin,15min,30min,60min,90min不同时间点HG培养条件下HBZY-1细胞smad3磷酸化蛋白的表达。9.选取HG诱导HBZY-1细胞smad3磷酸化蛋白表达最显著的时间点,应用免疫印迹法检测该时间点HG联合不同浓度BPS培养HBZY-1细胞smad3磷酸化蛋白的表达。10.统计学处理：实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,各组计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示。采用析因方差分析方法进行主效应和交互效应的分析；多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齐时,用Welch法校正,多重比较采用Dunnett’s T3法；两独立样本比较采用t检验。P≤0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞增殖活性的影响：不同处理组分别培养24h,48h后各组细胞O.D.值均有显著差异(24h: F=5.977, P<0.001;48h:F=25.585, P<0.001)。与NG组相比,HG组培养24h及48h后HBZY-1细胞O.D.值均显著增加(P均<0.001)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h及48h,与HG组相比,除HG+0.1uMBPS组外,其余5个BPS浓度处理组O.D.值均显著低于HG组(24h:P=0.044;48h:P<0.001)。根据本组实验的结果,选取0.5、1、2、5uM等4个浓度作为后续实验中BPS的处理浓度。2.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1蛋白表达的影响：不同处理组分别培养细胞24h,48h后各组细胞TGFβ1蛋白表达量差异有统计学意义(24h:F=26.441, P<0.001;48h:F=14.939, P<0.001)。与NG组相比,HG组分别培养24h及48h后]HBZY-1细胞TGFβ1蛋白表达量均显著增加(P<0.001)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h后,与HG组相比,HG+1uMBPS组、HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞TGFβ1蛋白表达量均显著降低(P=0.001)；HG联合不同浓度BPS培养细胞48h后,与HG组相比,各浓度BPS组细胞TGFβ1蛋白表达量呈浓度依赖性下降(P=0.011)。3.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞FN蛋白表达的影响：不同处理组分别培养细胞24h,48h后各组细胞FN蛋白表达量差异有统计学意义(24h:F=5.445, P=0.008;48h:F=10.736, P<0.001)。与NG组相比,HG组分别培养24h及48h后HBZY-1细胞FN蛋白表达量均显著增加(P=0.001)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h后,与HG组相比,HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞FN蛋白表达量均显著降低(P值分别为0.018,0.007)；HG联合不同浓度BPS培养细胞48h后,与HG组相比,HG+1uMBPS组、HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞FN蛋白表达量均显著降低(P=0.005)。4.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MMP-2蛋白表达的影响：不同处理组分别培养细胞24h,48h后各组细胞MMP-2蛋白表达量差异有统计学意义(24h:F=7.232, P=0.002;48h:F=4.610, P=0.014)。与NG组相比,HG组分别培养HBZY-1细胞24h及48h后,细胞MMP-2蛋白表达量均显著下降(P=0.001)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h后,与HG组相比,HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞MMP-2蛋白表达量显著增加(P值分别为0.017,0.001)；HG联合不同浓度BPS培养细胞48h后,与HG组相比, HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞MMP-2蛋白表达量显著增加(P值分别为0.019,0.007)。5.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1mRNA表达的影响：与NG组相比,HG组细胞TGFβ1mRNA相对表达量明显增加(2.45±0.22vs.1.00±0.00,HG组均数的95%置信区间为[1.92,2.99])。与HG组相比,HG+0.5uMBPS组、HG+1uMBPS组、HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞TGFβ1mRNA表达水平逐渐下降,差异具有统计学意义(P=0.008)。6.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞FN mRNA表达的影响：与NG组相比,HG组细胞FN mRNA表达相对量明显增加(1.93±0.23vs.1.00±0.00,HG组均数的95%置信区间为[1.36,2.51])。与HG组相比,HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞FN mRNA相对表达量显著下降,差异具有统计学意义(P值分别为0.006,<0.001)。7.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MMP-2mRNA表达的影响：与NG组相比,HG组细胞MMP-2mRNA表达相对量显著下降(0.528±0.132vs.1.000±0.000, HG组均数的95%置信区间为[0.199,0.857])。与HG组相比,HG联合不同浓度BPS组细胞MMP-2mRNA相对表达量有上升趋势。但统计学分析提示,HG组与HG联合不同BPS浓度组,各组细胞MMP-2mRNA相对表达量差异无统计学意义(F=0.906,P=0.497),可能与样本量偏小,或检测MMP-2mRNA时间点的选择有关。8.不同时间点高糖诱导HBZY-1细胞p38MAPK磷酸化蛋白的表达：HG Omin组细胞有少量磷酸化p38MAPK蛋白表达,HG刺激15min后细胞p38MAPK磷酸化蛋白表达最明显,刺激30min后p38MAPK磷酸化蛋白的表达开始减弱,刺激90min磷酸化p38MAPK蛋白信号仍未消失。9.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞p38MAPK蛋白磷酸化的影响：不同处理组刺激细胞15min后,HG组HBZY-1细胞p38MAPK磷酸化蛋白表达与NG组相比明显增多(P<0.001)；与HG组比较,HG联合不同浓度的BPS培养细胞,随着BPS药物浓度的增加,细胞p38MAPK磷酸化蛋白表达逐渐减少(P=0.006)。10.不同时间点高糖诱导HBZY-1细胞ERK磷酸化蛋白的表达：HG Omin细胞有少量磷酸化ERK蛋白表达,HG刺激15min后细胞ERK磷酸化蛋白表达明显增多,刺激30min后ERK磷酸化蛋白的表达开始减弱,刺激至90min磷酸化p38MAPK蛋白条带仍未消失。11.不同浓度BPS对高糖环境中HBZY-1细胞ERK蛋白磷酸化的影响：HG刺激15min后,HG组HBZY-1细胞ERK磷酸化蛋白表达比NG组明显增多(P<0.001)；与HG组比较,HG联合不同浓度的BPS培养细胞,随着BPS药物浓度的增加,细胞ERK磷酸化蛋白表达水平逐渐减少(P<0.001)。12.不同时间点高糖诱导HBZY-1细胞Smad3蛋白磷酸化的表达：HG Omin及HG15min组未能检测到细胞Smad3磷酸化蛋白的表达；HG30min组Smad3磷酸化蛋白开始表达,HG刺激60min时Smad3磷酸化蛋白表达最明显,刺激90min时明显减弱。13.不同浓度BPS对高糖环境中HBZY-1细胞Smad3蛋白磷酸化的影响HG刺激60min后,HG组HBZY-1细胞Smad3磷酸化蛋白与NG组比较表达增多(P=0.007)；与HG组相比,HG+2uMBPS组与HG+5uMBPS组细胞Smad3磷酸化蛋白表达水平明显下降(P值分别为0.012,0.004)。[结论]1.BPS能够抑制高糖环境下HBZY-1细胞的增殖；2.BPS能够抑制高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN蛋白质的合成及mRNA的表达,并增加了HBZY-1细胞MMP-2蛋白质的合成；3.BPS能够抑制高糖环境下HBZY-1细胞p38MAPK、ERK磷酸化蛋白表达与Smad3蛋白的磷酸化。BPS可能通过不同信号转导通路间的相互作用,对高糖环境下HBZY-1细胞ECM合成与代谢过程进行保护性的调控。第二章贝前列素钠对高糖环境下大鼠系膜细胞MCP-1表达的影响[目的]1.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1蛋白质表达的影响。2.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1mRNA表达的影响。3.探讨NFκB信号通路是否参与了BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1表达的调控。[方法]1.细胞培养同第一章2.细胞处理分组：NG组,HG组,HG联合不同浓度BPS (0.5uM,1uM,2uM与5uM)组,增加HG+PDTC (1uM)组。3.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于24h,48h收集细胞培养上清液,用Elisa法测定细胞培养上清液中MCP-1蛋白质的表达量。4.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于24h收集细胞,用实时荧光定量(real-time) PCR法测定细胞MCP-1mRNA的相对表达量(2-△△Ct)。5.用免疫印迹法分别检测Omin,15min,30min,60min,90min不同时间点HG培养条件下HBZY-1细胞NFκB p65亚基核转位的情况。6.选取HG诱导HBZY-1细胞NFκB p65亚基核转位最显著的时间点,应用免疫印迹法检测改时间点HG联合不同浓度BPS培养HBZY-1细胞NFκBp65亚基核转位的变化情况。7.用细胞免疫荧光染色法观察不同处理组NFκB p65亚基核转位的变化。8.统计学处理：同第一章。[结果]1.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1蛋白表达的影响：不同处理组分别培养细胞24h,48h后各组细胞MCP-1蛋白表达量差异有统计学意义(24h:F=6.973, P=0.001;48h:F=10.436, P<0.001)。与NG组相比,HG组分别培养24h及48h后HBZY-1细胞MCP-1蛋白表达量均显著增加(P<0.001)。与HG组比较,HG+PDTC组分别培养细胞24h、48h后,细胞MCP-1蛋白表达量均显著下降(P<0.001)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h后,与HG组相比,HG+1uMBPS组、HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞MCP-1蛋白表达量显著降低(P=0.006)；HG联合不同浓度BPS培养细胞48h后,与HG组相比,HG+luMBPS组、HG+2uMBPS组及HG+5uMBPS组细胞MCP-1蛋白表达量显著降低(P=0.003)。2.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1mRNA表达的影响：与NG组相比,HG组细胞MCP-1mRNA表达相对量明显增加(4.62±0.12vs1.00±0.00,HG组均数的95%置信区间为[4.32,4.93])。与HG组相比,HG+PDTC组细胞MCP-1mRNA相对表达量显著下降(P<0.001)；HG联合不同浓度BPS组细胞MCP-1mRNA相对表达量较HG组均显著下降(P=0.011)。3.不同时间点高糖诱导的HBZY-1细胞NFκB p65核转位的变化HG Omin组细胞核内检测到少量NFκB p65蛋白的表达,HG刺激5min后即可检测到核内NFκB p65蛋白表达的增加；随着刺激时间的延长,核内NFκBp65蛋白的表达量逐渐增加,于刺激90min时最为明显,刺激120min时开始减弱。胞浆内NFκB p65蛋白在HG0min表达最明显,HG刺激5min后胞浆内NFκB p65蛋白表达量开始减少；随着刺激时间的延长,胞浆内NFκB p65蛋白的表达逐渐减少,至90min时表达量最少。4.免疫印迹法检测不同浓度BPS对高糖诱导的HBZY-1细胞NFκB p65核转位的影响HG刺激90min后,HG组HBZY-1细胞核内NFκB p65蛋白表达与NG组比较明显增多。HG联合不同浓度的BPS培养细胞,与HG组相比,HG+luMBPS组、HG+2uMBPS组与HG+5uMBPS组胞核NFκB p65蛋白表达逐渐减少(P=0.001)。HG刺激90min后,HG组HBZY-1细胞胞浆NFκB p65蛋白表达较NG组减少。HG联合不同浓度的BPS培养细胞,与HG组相比,HG+2uMBPS组与HG+5uMBPS组胞浆NFκB p65蛋白表达逐渐增多(P分别为0.049,0.034)。5.细胞免疫荧光法观察BPS对高糖诱导的HBZY-1细胞NFκB p65核转位的影响各不同处理组培养细胞90min后,NG组NFκB p65红色荧光均显示于胞浆中,胞核中未见NFκB p65红色荧光。HG组NFκB p65红色荧光集中于胞核中,胞浆中仅有少量NFκB p65红色荧光。用PDTC预先处理细胞1h抑制NFκB的活化,HG+PDTC组细胞NFκB p65红色荧光在胞核中的表达明显减少。与HG组比较,HG+2uMBPS组NFκB p65红色荧光在核内显示明显减少,在胞浆内显示明显增多,与HG+PDTC组结果相似。[结论]1.BPS能够抑制高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1蛋白质的合成及mRNA的表达；2.BPS能够抑制高糖环境下HBZY-1细胞NFκB p65亚基的核转位,从而抑制了高糖诱导的NFκB的激活,可能参与了BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1表达的调控。第三章PPARβ/δ在贝前列素钠减轻高糖对系膜细胞损伤中的作用[目的]1.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞PPARβ/δ蛋白表达的影响。2.观察不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞PPARβ/δ mRNA表达的影响。3.观察选择性PPARβ/δ受体拮抗剂GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN与MMP-2合成的影响。4.观察GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞MAPK信号通路的影响。5.观察GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1表达的影响。6.观察GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞NFκB-DNA结合活性的影响。[方法]1.细胞培养同第一、二章。2.细胞处理分组：NG组,HG组,HG+2uMBPS组,HG+GSK0660(5uM)组, HG+2uMBPS+GSK0660(5uM)组,HG+PDTC (1uM)组。3.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于24h收集细胞,用免疫印迹法检测细胞PPARβ/δ蛋白质的表达量。4.不同处理组体外培养HBZY-1细胞,于12h收集细胞,用实时荧光定量(real-time) PCR法测定细胞PPARβ/δ mRNA的相对表达量(2-△△Ct)。5.正式刺激前,提前用GSK0660预处理细胞1h拮抗PPARβ/δ受体的作用,然后按上述处理分组继续培养细胞24h。6.收集细胞培养上清液用Elisa法测TGFβ1、FN及MMP-2的蛋白质表达。7. HBZY-1细胞p38MAPK、Erk1/2磷酸化蛋白表达测定同第一章。8.收集细胞培养上清液用Elisa法测MCP-1的蛋白质表达量。9.应用EMSA法检测NFκB p65-DNA结合活性变化。10.统计学处理：同第一、二章。[结果]1.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞PPARβ/δ蛋白表达的影响NG组HBZY-1细胞核内存在PPARβ/δ蛋白的表达。与NG组相比,HG培养24h后胞核PPARβ/δ蛋白表达量减少(P=0.028)。HG联合不同浓度BPS培养细胞24h后,各组胞核PPARβ/δ蛋白表达量均较HG组增加(P=0.009)。在不同浓度BPS组中,HG+2uMBPS组PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表达相对量升高最明显(P<0.001vs. HG+0.5uMBPS); HG+5uMBPS组PPARβ/δ/Lamin B1蛋白表达相对量较HG+2uMBPS组下降(P=0.017vs. HG+2uMBPS)。2.不同浓度BPS对高糖环境下HBZY-1细胞PPARβ/δ mRNA表达的影响：与NG组相比,HG组细胞PPARβ/δ mRNA表达相对量明显下降(0.69±0.02vs.1.00±0.00,HG组均数的95%置信区间为[0.64,0.73])。与HG组相比,HG联合不同浓度BPS组细胞PPARβ/δ mRNA相对表达量均显著上升(P<0.001)。在不同浓度BPS组中,HG+2uMBPS组PPARβ/δ mRNA表达相对量升高最明显(P<0.001vs. HG+0.5uMBPS); HG+5uMBPS组PPARβ/δ mRNA表达相对量较HG+2uMBPS组下降(P<0.001vs. HG+2uMBPS)。3.GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1合成的影响：不同处理组培养细胞24h后,各组细胞TGFβ1蛋白表达量有显著差异(F=16.429,P<0.001)。与NG组相比,HG培养24h后细胞TGFβ1蛋白表达量显著增加(P<0.001)。与HG组比较,HG+2uMBPS组培养24h后细胞TGFβ1蛋白表达量显著下降(P=0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660组细胞TGFβ1蛋白表达量与HG+2uMBPS组比较显著上升(P=0.049)；而HG+GSK0660组与HG组比较,两组细胞TGFβ1蛋白表达量差异无统计学意义(P=0.621)。4.GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞FN合成的影响：不同处理组培养细胞24h后,各组细胞FN蛋白表达量有显著差异(F=26.493,P<0.001)。与NG组相比,HG培养24h后细胞FN蛋白表达量显著增加(P<0.001)；与HG组比较,HG+2uMBPS组培养24h后细胞FN蛋白表达量显著下降(P=0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660组细胞FN蛋白表达量与HG+2uMBPS组相比显著上升(P=0.047)；而HG+GSK0660组与HG组比较,两组FN蛋白表达量变化不明显,差异无统计学意义(P=0.592)。5.GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞MMP-2合成的影响：不同处理组培养细胞24h后,各组细胞MMP-2蛋白表达量有显著差异(F=10.269,P=0.001)。与NG组相比,HG组细胞MMP-2蛋白表达量显著下降(P<0.001)；与HG组比较,HG+2uMBPS组细胞MMP-2蛋白表达量显著上升,(P=0.017)。HG+2uMBPS+GSK0660组细胞MMP-2蛋白表达量与HG+2uMBPS组比较变化不明显,差异无统计学意义(P=0.956); HG+GSK0660组与HG组比较,两组细胞MMP-2蛋白表达量变化不明显,差异无统计学意义(P=0.958)。6.GSK0660对HG高糖环境下HBZY-1细胞p38MAPK信号通路的影响：HG刺激15min后,与NG组比较,细胞内p38磷酸化蛋白表达显著增加(P<0.001)。HG+2uMBPS组与HG组比较,细胞内磷酸化p38蛋白表达减少(P<0.001)。与HG+2uMBPS组比较,HG+2uMBPS+GSK0660组细胞内磷酸化p38蛋白表达明显增加(P<0.001)。HG+GSK0660组与HG组比较,细胞磷酸化p38蛋白表达变化不明显(P=0.061)。7.GSK0660对HG高糖环境下HBZY-1细胞ERK信号通路的影响：HG刺激15min后细胞内ERK磷酸化蛋白表达较NG组显著增加(P<0.001)。与HG组比较,HG+2uMBPS组细胞内ERK磷酸化蛋白表达明显下降(P<0.001)。HG+2uMBPS+GSK0660组细胞内ERK磷酸化蛋白表达较HG+2uMBPS组有所增加(P<0.001)。HG+GSK0660组与HG组比较,细胞内磷酸化ERK蛋白表达水平无明显变化(P=0.093)。8.GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1合成的影响：不同处理组培养细胞24h后,各组细胞MCP-1蛋白表达量有显著差异(F=11.402,P=0.001)。与NG组相比,HG组细胞MCP-1蛋白表达量显著增加(P<0.001)。与HG组比较,HG+2uMBPS组细胞MCP-1蛋白表达量显著下降(P=0.004)。HG+2uMBPS+GSK0660组MCP-1蛋白表达量与HG+2uMBPS组相比显著上升(P=0.042)；而HG+GSK0660组与HG组比较,两组MCP-1蛋白表达量变化不明显,差异无统计学意义(P=0.847)。9.GSK0660对高糖环境下HBZY-1细胞NFκB p65-DNA结合活性的影响：NG组未见NFκB-DNA的结合条带,HG组可见明显的NFκB-DNA结合条带,说明HG导致NFκB的激活,并且促进了NFκB与DNA的结合。用PDTC预处理细胞后,HG+PDTC组NFκB-DNA结合条带比HG组明显减弱,HG+GSK0660组NFκB-DNA结合条带与HG组比较变化不明显,提示GSK0660拮抗RRARβ/δ受体的作用后对HG导致的NFκB的激活没有影响。HG+2uMBPS组的NFκB-DNA结合条带比HG组明显减弱,与HG+PDTC组的结果相似,说明2uM BPS能够抑制HG诱导的NFκB与DNA的结合。HG+2uMBPS+GSK0660组的NFκB-DNA结合条带比HG+2uMBPS组有所增强,提示BPS能够通过与RRARβ/δ受体作用,抑制HG诱导的NFκB与DNA的结合。[结论]1.BPS能够上调高糖环境下HBZY-1细胞PPARβ/δ蛋白与1mRNA的表达；2.GSK0660能够逆转BPS对高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN合成的抑制作用；而对BPS增加细胞MMP-2的合成没有影响,提示BPS能够通过与PPARβ/δ受体结合,调节高糖环境下HBZY-1细胞TGFβ1、FN的合成；而BPS对细胞MMP-2的合成调节作用可能不通过PPARβ/δ受体途径；3.GSK0660能够拮抗BPS对高糖环境下HBZY-1细胞内p38MAPK、ERK蛋白磷酸化的抑制作用；提示BPS可以通过与PPARβ/δ受体结合,抑制HG诱导的p38MAPK与ERK的激活；4.GSK0660能够逆转BPS对高糖环境下HBZY-1细胞MCP-1合成的抑制作用,提示BPS可以通过与PPARβ/δ受体结合,调节高糖环境下HBZY-1细胞的MCP-1的表达；5.GSK0660能够拮抗BPS对高糖环境下HBZY-1细胞NFκB-DNA结合活性的抑制作用,提示BPS通过与PPARβ/δ受体结合,抑制了HG诱导的NFκB与DNA的结合。以上结果说明,BPS可以通过与细胞核受体PPARβ/δ的结合,对高糖环境下的大鼠系膜细胞HBZY-1起到了的一定保护作用。