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在医疗技术高度发展的今天,随着介入治疗等各种高端医疗手段的广泛应用,急性心肌梗死患者的生存率发生了明显的改变,但是由此所导致的心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion,IR)却严重影响着患者的生存质量,因此多年来,如何保护再灌注后的受损心肌成为研究者们倍感兴趣的课题。IR损伤的机制非常复杂,包括氧自由基生成增加、炎症反应、细胞凋亡、钙超载、线粒体损伤、内皮细胞活化和损伤以及自噬等。其中自噬是继凋亡后的又一热点,被认为在心肌缺血-再灌注损伤中发挥着举足轻重的作用。自噬(Autophagy)是细胞内细胞器和蛋白的自我降解过程,自噬体通过与溶酶体结合,参与细胞内的降解过程,自噬在细胞的分化,生存,及其维持稳态中起到了不可或缺的作用。细胞自噬通过降解细胞内不稳定的蛋白质以及遭到破坏的细胞器,减轻其对细胞的损害作用,分解得到氨基酸等细胞代谢所必须的底物,维持细胞的自身稳态。自噬在心肌缺血再灌注损伤的不同阶段扮演着双重角色,缺血期自噬轻度增加具有保护心肌的作用,但是在再灌注期自噬进一步增加,反而加重心肌的损伤。大量研究证实,再灌注后心肌细胞自噬的异常增多是导致心脏结构和功能受损的重要原因之一。如果能够在早期有效地抑制心肌自噬的发生,有望成为心肌保护的一条新途径。近年来的研究发现,褪黑素具有抗氧化应激而减轻IR的作用,且褪黑素具有广谱的器官保护作用,因此成为心肌保护领域的研究热点。动物及细胞实验证明新型褪黑素受体激动剂Neu-P11能激活褪黑素受体而起到类似褪黑素的作用,但Neu-P11是否能够减轻心肌细胞缺氧复氧损伤,并明显减轻缺血/再灌注损伤大鼠的心功能损害,及其对心肌细胞自噬的影响目前尚未有文献报道。研究目的:本实验通过体外培养的H9c2心肌细胞及在体SD大鼠,建立缺血再灌注损伤的体外和体内模型,并以Neu-P11进行干预。通过检测各组心肌细胞活力改变,心肌酶学及心肌血流动力学变化,心肌梗死面积等评价Neu-P11对缺血再灌注损伤的拮抗作用;并进一步通过检测心肌细胞自噬率,Western-blot检测细胞和心肌组织的自噬相关基因的蛋白表达水平,从细胞和整体水平探讨Neu-P11对缺血再灌注损伤心肌细胞自噬的影响;通过给予mTOR抑制剂雷帕霉素,明确了mTOR信号转导通路在Neu-P11抑制缺血再灌注损伤心肌细胞自噬中的作用,为探明褪黑素受体激动剂的心肌保护作用提供新的理论基础。研究方法和结果:第一部分Neu-P11对体外培养的H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用研究:培养H9c2心肌细胞,利用缺氧复氧建立体外缺血再灌注模型。实验分为6组:对照组、缺氧复氧组(H/R组)、Neu-P11 1n M组+缺氧复氧组(Neu-P11 1n M+H/R组)、Neu-P11 10n M组+缺氧复氧组(Neu-P11 10n M+H/R组)、Neu-P11 100n M组+缺氧复氧组(Neu-P11100n M+H/R组)、氯喹+缺氧复氧组(CQ+H/R组),MTT法检测心肌细胞活力,检测培养液中LDH、CK、CK-MB的含量,MDC染色后流式细胞仪检测心肌细胞自噬率,Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62的表达。结果显示:MTT法检测各组心肌细胞活力结果显示:缺氧复氧组心肌细胞活力明显低于对照组,而经Neu-P11及自噬抑制剂氯喹处理后,心肌细胞活力明显高于缺氧复氧组;LDH、CK、CK-MB检测结果显示Neu-P11组、CQ组明显低于缺氧复氧组,说明Neu-P11能够减轻缺氧复氧所致的心肌细胞损伤,改善心肌细胞活力,并且呈现浓度依赖性,以100n M浓度时效果最佳,其效果与氯喹相似。MDC检测自噬率以及Western blot检测自噬相关蛋白,发现Neu-P11、氯喹均能抑制缺氧复氧后心肌细胞自噬,说明Neu-P11是通过抑制自噬起到心肌保护作用的。第二部分Neu-P11对在体心肌缺血-再灌注损伤的影响:用结扎大鼠冠状动脉前降支30min,松解结扎线恢复灌注120min的方法,建立在体缺血再灌注损伤模型。结扎动脉前30min通过腹腔注射Neu-P11,生化方法检测血清LDH、CK、CK-MB的含量,检测心肌动力学的改变,TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积,明确Neu-P11对在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响。Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62,考察Neu-P11对心肌细胞自噬的抑制作用;结果显示:通过结扎冠状动脉方法建立缺血再灌注模型,缺血前30min通过腹腔注射Neu-P11,发现Neu-p11可以改善缺血再灌注损伤大鼠血流动力学指标,降低血清LDH、CK、CK-MB含量,减少心肌梗死面积,表明Neu-P11能够保护心肌细胞受缺血再灌注损伤。Western blot检测发现Neu-P11药物处理组大鼠心肌Beclin-1、LC3-II/LC3-I的比值均低于缺血再灌注组,而p62水平有所上升,与CQ处理组比较差异无统计学意义(P>0.05),说明Neu-P11在体内抑制了细胞自噬。第三部分Neu-P11通过激活mTOR通路抑制自噬:培养H9c2心肌细胞,利用缺氧复氧培养模拟离体缺血再灌注损伤。实验分为5组:对照组、缺氧复氧组(H/R组)、Neu-P11 100n M+缺氧复氧组(Neu-P11 100n M+H/R组)、雷帕霉素(25mmol/L)+缺氧复氧组、雷帕霉素(25mmol/L)+Neu-P11 100n M+缺氧复氧组,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62及mTOR信号通路相关蛋白(p-mTOR、p-p70s6k、p-4EBP1)的表达。结果显示:100n M的Neu-P11处理H9c2心肌细胞后,Beclin-1、LC3-II/LC3-I的比值均较缺氧复氧组显著降低(P<0.05),p62水平较缺氧复氧组提高,提示Neu-P11能够抑制自噬;25mmol/L的雷帕霉素干预后Beclin-1、LC3-II/LC3-I的比值均显著升高(P<0.05),p62水平显著降低。100n M的Neu-P11处理H9c2心肌细胞后,p-mTOR及其下游磷酸化蛋白p-p70s6k、p-4EBP1的表达水平均显著上调(P<0.05),提示mTOR通路被激活;雷帕霉素干预后mTOR通路相关蛋白的表达均显著下调(P<0.05),表明Neu-P11抑制心肌细胞自噬的作用是通过mTOR信号通路实现的。结论:1.Neu-P11可以通过减少缺氧复氧诱导的心肌细胞自噬改善缺氧复氧损伤心肌细胞活力、降低LDH、CK、CK-MB的水平,保护心肌功能。2.Neu-P11可以通过抑制缺血再灌注损伤心肌细胞的自噬,缩小相对心肌梗死面积、降低LDH、CK、CK-MB的水平,保护心功能。3.Neu-P11通过激活m TOR信号通路抑制心肌细胞自噬。