氧化石墨烯（Graphene oxide, GO）作为单原子层碳材料，因其超大的比表面积、良好的生物相容性和亲水性等特性吸引了越来越多的关注。氧化石墨烯表面具有多种活性含氧官能团，如羟基（-OH）、羧基（-COOH）等，适于表面的功能化修饰，可以与其他有机材料反应制备复合材料，特别是在固定化蛋白方面具有巨大的应用潜力。然而，受限于官能团较少等缺点，氧化石墨烯固定化蛋白的负载能力和可接近性尚待进一步提高。　　表面引发的原子转移自由基聚合（SI-ATRP）指的是在具有活性基团的基底表面，以简单的有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为卤原子载体，通过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，从而实现可控的聚合反应。SI-ATRP是受控自由基聚合（CRP）中最有效和最广泛使用的方法之一。相比将长链聚合物接枝在基质上，SI-ATRP首先将引发剂固定到基底材料表面上，接着在原位引发并延长聚合物链,因此在载体表面接枝的聚合链数量明显高于直接连接，并可有效控制接枝聚合物链的三维空间结构、厚度及接枝密度。SI-ATRP在工业中已经应用于多种聚合方法，目前正在研究用于医疗和环境领域。SI-ATRP可以相对简单的方法形成聚合物，通过将单体以受控的、逐件（piece-by-piece）的方式组合在一起，通过这种方法，可以简单且稳固地将聚合物刷接枝到被引发的固定表面上。SI-ATRP可以制备不同分子量和分子类型的聚合物，范围广泛，并可针对具有高价值应用的特定性质位点特异地定制功能。　　鉴上，我们在此提出一种新的固定化蛋白方法，通过SI-ATRP在GO上进行原位聚合物接枝，制备线性聚合物刷杂化GO，进而在接枝聚合物上固化蛋白（以胰蛋白酶与HER-2受体为示范分子），以提高其负载能力，并对其应用进行系统的验证。　　本研究主要包括两部分：　　第一部分：基于GO的固定化酶的制备以及酶切效率的研究　　基于质谱法的“自下而上”（Bottom-up）策略是蛋白质组学研究中最广泛使用方法，这种方法使用蛋白酶将蛋白质样品消化成肽段混合物，然后通过液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定肽段混合物样品，接着在相应数据库检索得到质谱数据，最终获得相应的蛋白质的详细信息。在该策略中，蛋白质的定量和定性信息是来源于分析鉴定蛋白质酶解后的肽段产物得到的。因此，蛋白质的酶解消化成为这种研究策略中的关键步骤。　　与传统的基于溶液的游离蛋白酶消化低效耗时相比，固定化蛋白酶为快速高效的消化提供了一个有前景的替代方案，这种方法可明显提高样品处理量。在本研究中，我们开发出了一种新的固定化蛋白酶消化策略，即在GO表面接枝两种不同聚合物，并在其上固定胰蛋白酶。使用SI-ATRP反应在氧化石墨烯表面接枝聚合物，并通过AFM，TEM，TGA和XPS表征进行确认。研究结果显示，基于GO的聚合物对胰蛋白酶的负载量达到773.9 mg/g。聚合物接枝在GO表面，支持三维胰蛋白酶固定。这种结构不仅增加了胰蛋白酶的负载量，还大大提高了其与蛋白底物接触的几率。酶切效率实验结果显示，两种类型的固定化胰蛋白酶的消化时间仅为游离胰蛋白酶溶液的1/700，且酶切结果与溶液酶切具有相同的蛋白质/肽鉴定规模。GO表面接枝不同聚合物的固定化酶联合酶切在蛋白质/肽段识别上至少增加18.3％及31.3%。　　由于SI-ATRP与各种单体相容，具有不同疏水性和静电特性的聚合物刷可以接枝在GO上，以操纵其对不同理化特性蛋白质的亲和力，从而实现更全面的蛋白质组消化。因此，这种固定化酶切方法在涉及大量样品处理的高通量临床蛋白质组学研究具有一定的应用价值。　　第二部分：基于GO的固定化HER-2受体的制备以及HS630的LC-MS方法的建立与开发　　酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法是生物大分子药物药代动力学研究的经典方法。其具有灵敏度高、通量高、设备简易等优点，但也存在线性范围相对窄、易发生非特异性结合等缺点。近年来，基于液相色谱-质谱连用（LC-MS/MS）的方法由于具有特异性好、通量大以及可以进行结构确认等优点，也越来越多的应用于生物大分子药物的定量检测中。ELISA方法与LC-MS/MS方法联合应用，互相补充，可以更全面深入的揭示药物的药代动力学过程。然而，LC-MS/MS方法中如何将基质中大量的内源性蛋白质去除而不损失低浓度抗体药物的量是完成对其精确分析并获得准确药代动力学参数的关键。　　在本研究中，我们利用SI-ATRP聚合法，在GO表面原位接枝含醛基的长链聚合物刷，高效固定人表皮生长因子受体（HER-2），进而达到对抗体偶联药物（ADC）HS630的特异性捕获。由于GO具有超大的比表面积和柔性结构，其表面原位接枝长链聚合物不仅可以提高捕获受体的固载量，还可以降低与所富集药物接触的空间位阻，进一步提高药物富集的效率及特异性。我们对固定化受体与药物的结合与解离方法进行了初步研究，并初步开发了基于LC-MS/MS的HS630定量方法。采用ELISA定量分析HS630的方法学验证结果显示，方法的定量范围为1.56~100 ng/mL，精密度、准确度、特异性与选择性以及稳定性良好。我们用该ELISA方法对食蟹猴静脉滴注HS630（3 mg/kg）后的药代动力学进行了初步观察。结果显示，经过GO-PAA-HER-2固定化受体富集前处理后使用LC-MS/MS方法检测得到的血药浓度-时间变化与既往使用ELISA方法所得到的结果基本趋势一致，初步证明此种方法有可能运用于HS630药代动力学研究，但两种方法所检测到的具体样品血药浓度数值存在一定差异，总体趋势是LC-MS/MS方法检测得到的血药浓度偏低。推测与生物样品保存时间较长，被分析物存在降解有关。　　在下一步的工作中，我们将更全面的利用GO固定化HER-2受体特异性捕获结合LC-MS/MS的方法观察HS630在食蟹猴体内的药代动力学，与ELISA方法所获得的结果相互比较，以期更全面地了解新方法的性能、特点及优劣，推动GO固定化蛋白捕获结合LC-MS/MS的定量方法在大分子药物生物分析与药代动力学研究中的应用。