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近年来脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）发生率呈上升趋势,世界各国对脊髓损伤发生率之统计约为每年每百万人口50例,且以青壮年为主,其高致残率、高耗费给患者本人、家庭和社会都带来巨大负担,也是神经科学工作者和临床工作者的机遇与挑战,加强脊髓损伤的基础研究与临床救治具有十分重要的意义。 保护神经元免于继发性死亡是脊髓损伤治疗的基础,目前实验性治疗中,通过提供神经营养因、基因转移等手段,改善神经元的微环境,干预其基因调控,可达到这一目的;另一方面,神经元轴突延伸至靶细胞重建解剖连接是功能恢复的关键,而胶质瘢痕形成和神经元轴突延伸相对过慢,限制了轴突通过损伤区,如何有效解决这一矛盾对功能恢复具有重要意义。 N-Bak基因是2001年Arumae等在研究Bak基因在神经元中表达及功能时发现并命名,其内源性mRNA仅特异性表达于神经元,翻译产物为仅含BH3保守区的蛋白,分子量为22kd。与其他Bcl2家族成员不同的是,N-Bak过表达于培养的颈上神经节（Superior cervical ganglion, SCG）可显著拮抗NGF撤除诱导的神经元凋亡,而过表达于非神经元细胞（COS7、HeLa）则具有较强的促凋亡作用。突变分析表明,其在神经元的抗凋亡作用可能涉及其BH3区外的某一特殊“N-Bak式结构”,而其在非神经元细胞的促凋亡作用需BH3区参与。 本实验拟以腺病毒为载体,介导N-Bak基因转移,观察红核脊髓束损伤后N-Bak能否支持神经元免于继发性死亡,促进红核脊髓束的再生和运动功能恢复。 主要方法及技术路线: 1.PCR扩增获得并修饰N-Bak片段,构建穿梭质粒pDC316-N-Bak和pDC316-EGFP,与病毒基因组载体质粒共转染293细胞,利用Cre/loxp位点同源重组方法构建AdCMV-N-Bak和AdCMV-EGFP,进行RT-PCR、酶切、免疫组化染色鉴定后,大量扩增并以CsCl梯度法纯化,空斑试验检测重组病毒滴度。 2.培养大鼠皮层神经元,以H2O2诱导神经元凋亡,再行AdCMV-N-Bak转染以确定N-Bak是否具有保护神经元保护作用;培养星形胶质细胞并转染AdCMV-N-Bak ＜WP=11＞ 以确定N-Bak对其作用。 3.制作大鼠颈3外侧索横切损伤模型（C3Hx）,损伤区和红核应用AdCMV-N-Bak,C2和C5注射FG以逆行示踪红核神经元的存活和轴突再生,并做病理等观察;以不对称试验观察行为学的改变以判断动物前肢运动功能的恢复。 主要结果及结论: 1.成功构建了pDC316-N-Bak穿梭质粒,测序验证了其可靠性,以此与腺病毒基因组载体质粒共转染293细胞,应用Cre/loxp位点细胞内同源重组方法构建E1/E3区缺失AdCMV-N-Bak载体,同时构建AdCMV-EGFP对照载体,经PCR、RT-PCR和免疫组化鉴定证实重组腺病毒载体构建成功。大量扩增后进行CsCl梯度离心纯化,并行病毒滴度分析,滴度达1.3×1010-2.5×1011PFU/ml,满足本实验的细胞和在体试验要求。 2.AdCMV-N-Bak转染培养的大鼠皮层神经元,可对抗H2O2诱导的神经元凋亡,诱导凋亡前5d转染N-Bak神经元凋亡百分比为5.92%,而非转染组为12.63%; AdCMV-N-Bak转染培养的大鼠星形胶质细胞72hr后可显著促进其凋亡和坏死,转染组星形胶质细胞流式检测存活率仅为18.7%,而对照组为91.05%（p＜0.001）。表明N-Bak转染神经元具有抗凋亡作用,而转染星形胶质细胞则具有促凋亡作用。 3.大鼠C3Hx损伤后1-8w,各组存活神经元均明显减少。损伤后8w,N-Bak治疗组红核神经元存活率达85%,而损伤组仅为65%,表明C3Hx后红核神经元存在继发性损伤,AdCMV-N-Bak的应用具有保护红核神经元的作用。 4.大鼠C3Hx损伤后4w,N-Bak治疗组脊髓GFAP免疫组化染色较损伤组显著下降;8w N-Bak治疗组红核神经元轴突再生比例达18.14%,而损伤组只有4.6%。表明N-Bak抑制了损伤区星形胶质细胞增生反应,利于轴突延伸。 5.大鼠C3Hx损伤后伤肢使用显著减少,2w后动物开始使用伤肢,但使用伤肢和双肢时间各组间无明显差异;4w后,N-Bak治疗组动物使用伤肢及双肢时间明显增加,与对照组比较差异显著（P＜0.001）;8w时N-Bak治疗组动物使用伤肢及双肢时间之和达38%,而损伤组为22%,表明N-Bak显著改善了动物SCI后运动功能的恢复。