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目的:恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma,MM）是一种高度恶性肿瘤,好发于皮肤,我国与东亚地区发生于口腔黏膜者也不少见。有转移率高、预后较差的特点,早期可经血液转移和淋巴转移,且发病率呈逐年上升的趋势。随着肿瘤分子免疫学的快速发展,人们逐渐认识到黑色素瘤的发生、发展与患者机体的免疫功能密切相关,黑色素瘤患者体内可形成复杂而异质性的肿瘤微环境,导致肿瘤细胞滋长。针对黑色素瘤的免疫逃逸机制的研究,对临床免疫治疗方案,对患者预后判断及疗效评价具有指导意义。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（Phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN）是迄今发现的第1种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN编码的蛋白通过发挥磷酸酶作用,参与调控细胞内诸多重要的信号通路,如磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB又称AKT）信号传导通路,并通过多种途径抑制肿瘤的生长、侵袭、转移,并促进肿瘤细胞凋亡。有研究表明PTEN基因在人类多种肿瘤疾病中,包括恶性黑色素肿瘤,存在表达下调甚至缺失现象。本研究采用CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9）系统基因编辑技术敲除小鼠黑色素瘤细胞系（B16F10）的PTEN基因,并建立PTEN基因敲除的小鼠黑色素瘤模型与PTEN基因未敲除的小鼠黑色素瘤模型,观察比较两组小鼠肿瘤体积大小,比较两组小鼠脾脏中细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）和自然杀伤细胞（Natural Killer cell,NK）的相对数量。探讨PTEN基因失活后黑色素瘤免疫逃逸的具体作用途径;揭示PTEN基因失活在黑色素瘤免疫逃逸中的作用。方法:1实验材料1.1小鼠黑色素瘤高转移细胞（B16F10）:购置于中桥新舟公司1.2 C57BL\6小鼠:购置于河北医科大学动物中心（合格证编号11400700331927）2研究方法2.1采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得敲除PTEN基因的小鼠黑色素瘤高转移细胞系。通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和蛋白印迹法（Western Blot,WB）检测PTEN蛋白的表达情况对敲除PTEN基因的小鼠黑色素瘤高转移细胞系进行鉴定。2.2通过建立PTEN基因敲除组(PTEN-/-—B16F10组)与未敲除组(PTEN+/+—B16F10组)小鼠荷瘤模型,分析比较两组小鼠的肿瘤体积大小。采用蛋白印迹法检测两组小鼠肿瘤组织中PTEN蛋白的表达情况,对敲除PTEN基因的小鼠荷瘤模型进行鉴定。2.3使用流式细胞术（Flow CytoMetry,FCM）检测(PTEN+/+—B16F10)组、(PTEN-/-—B16F10)组、PBS组小鼠脾脏细胞中CTL细胞与NK细胞的相对数量。结果:1.(PTEN-/-—B16F10)细胞DNA测序结果显示:gRNA结合的部位出现无法匹配的序列,单点缺失,峰图单一,是双敲除。免疫组化和Western Blot检测结果均显示(PTEN-/-—B16F10)细胞中PTEN蛋白不表达;2.Western Blot检测(PTEN-/-—B16F10)组小鼠肿瘤组织中PTEN蛋白不表达;3.测量(PTEN-/-—B16F10)组与(PTEN+/+—B16F10)组小鼠肿瘤体积大小结果显示:在肿瘤细胞接种的第7天,第12天,第17天,第22天(PTEN-/-—B16F10)组大于(PTEN+/+—B16F10)组,各时间段均有显著性差异（P<0.05）;4.流式细胞术（Flow Cyto Metry,FCM）检测(PTEN-/-—B16F10)组、(PTEN+/+—B16F10)组、PBS组小鼠脾脏中NK细胞相对数量结果显示:在肿瘤细胞接种的第7天,第12天,第17天,第22天(PTEN-/-—B16F10)组与(PTEN+/+—B16F10)组,各时间段均没有显著差异（P>0.05）;5.流式细胞术检测(PTEN-/-—B16F10)组、(PTEN+/+—B16F10)组、PBS组小鼠脾脏中CTL细胞相对数量结果显示:在肿瘤细胞接种的第7天,第12天(PTEN-/-—B16F10)组低于(PTEN+/+—B16F10)组,但无显著性差异（P<0.05）,在肿瘤细胞接种的第17天,第22天(PTEN-/-—B16F10)组低于(PTEN+/+—B16F10)组,有显著性差异（P<0.05）;结论:1.成功构建了小鼠黑色素瘤PTEN基因缺失的荷瘤模型。2.在PTEN基因缺失的小鼠黑色素瘤中,肿瘤的生长速度明显加快。3.在小鼠黑色素瘤中,PTEN基因缺失可导致小鼠脾脏中CTL细胞数量减少,但NK细胞数量没有明显差异。4.在小鼠黑色素瘤中,PTEN基因缺失可导致小鼠免疫能力低下,机制是由于CTL细胞数量减少导致的。