论文部分内容阅读
目的:全球恶性肿瘤发病率和死亡率逐年递增,呈现出年轻化的趋势。尤其是肝癌,其治愈率低,死亡率高。对于其发病机制尚不清楚。在人类长期实践活动中发现许多天然倍半萜内酯化合物具有优良的抗肿瘤活性,且对正常细胞无毒副作用。本文主要通过细胞实验验证倍半萜内酯化合物小白菊内酯的抗肿瘤活性,研究其在人肝癌HepG2细胞中的抗肿瘤作用及其机制。方法:WST-8法检测在不同时间点和浓度下的小白菊内酯对HepG2细胞毒力的影响;流式细胞术分别检测小白菊内酯(PN)对细胞线粒体膜电位(?Ψm)、胞内钙离子浓度、细胞周期、细胞凋亡比例的影响;蛋白免疫印迹技术检测其对HepG2细胞死亡(凋亡、自噬)以及周期相关蛋白的影响;流式细胞术检测小白菊内酯(PN)对HepG2细胞内活性氧簇(ROS)的影响;比色法检测PN对细胞内还原型谷胱甘肽(rGSH)的影响;小白菊内酯(PN)联合应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)以及DL-丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)后对HepG2上述指标的影响。结果:随着小白菊内酯作用时间及给药浓度的增加,HepG2细胞变圆皱缩,核染色质致密深染,贴壁性变差,其增殖受到抑制,活力逐渐下降,细胞线粒体膜电位逐渐下降,当小白菊内酯作用于HepG2细胞12h时,细胞线粒体膜电位几乎消失,当小白菊内酯作用于HepG2细胞24h时,细胞线粒体膜电位完全消失。随着小白菊内酯作用于HepG2细胞时间的增加,细胞钙离子内流,细胞周期被阻滞于G1期,细胞发生凋亡比例增加,尤其是以晚期凋亡和坏死细胞为主;其凋亡相关蛋白caspase-3与caspase-9的剪切型均表达上调;其非Caspase依赖性凋亡,即Parthanatos凋亡相关AIF、MIF、PARP1蛋白的剪切型均呈现时间依赖性上调,凋亡抑制蛋白FLIP的长型与短型均有不同程度的表达下降;细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、becin-1表达上调,P62蛋白表达下调,其周期相关蛋白P53、P27、P21表达明显增加,CyclinD1及CyclinE1表达减少;而细胞内活性氧ROS随着PN作用时间的增加,其生成水平呈现增加趋势(P<0.001);细胞内还原型谷胱甘肽水平随着小白菊内酯作用时间的增加呈下降的趋势(P<0.001);而联合使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸后,细胞内ROS生成水平明显减少,细胞死亡几乎被完全阻断;当PN联用DL-丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)后,细胞凋亡,尤其是坏死比例较单独应用小白菊内酯或BSO均有明显的升高,差异显著(P<0.001),而细胞内ROS生成水平亦明显升高,差异显著(P<0.001)。结论:小白菊内酯通过降低HepG2肝癌细胞内还原型谷胱甘肽的水平,导致细胞内氧化还原平衡被打破,ROS过量积累产生氧化损伤,从而导致HepG2细胞周期阻滞,发生凋亡与自噬,从而发挥抗肿瘤作用,且BSO可增强Hep G2对小白菊内酯的敏感性。