组织样品中的蛋白质鉴定一直是生物学研究领域的一项具有挑战性的课题。基于LC-MS/MS平台的经典蛋白质组学虽然可以实现蛋白质的深度覆盖,从而提供全面的数据信息,但在样品制备过程中往往丢失了蛋白质分子的空间信息。近年来,蛋白质组学对于组织样品的空间分辨分析提出了更高的要求。虽然质谱成像技术解决了空间分辨分析的问题,但由于质谱技术的限制,理解质谱数据背后的生物学意义依旧十分困难。因此,目前迫切需要一种空间分辨的蛋白质组学分析方法。在本论文中,我们分别建立了聚丙烯酰胺晶胶原位酶解和L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针两种原位酶解方法,实现了空间分辨的蛋白质组学分析。全文包含以下几个部分:论文的第一章主要阐述了目前蛋白质组学研究中面临的问题和挑战,对经典蛋白质工作流中的样品制备方法进行了综述,并对现有的空间分辨蛋白质组学分析技术进行了总结。提出了本论文的研究目的在于实现空间分辨的蛋白质组学分析,并对蛋白质进行更深度的覆盖。论文的第二章中,我们利用聚丙烯酰胺晶胶原位酶解技术,将样品酶解和采样结合在一起,实现了空间分辨的蛋白质组学采样和分析。实验表明,管内聚合方式制备的聚丙烯酰胺晶胶尺寸更精准且容易操作。6%的聚丙烯酰胺晶胶孔径更大,具有更高的传质效率和负载量,在原位酶解蛋白质时表现更优。聚丙烯酰胺晶胶原位酶解采样技术的最小采样尺寸可达92 m,鉴定蛋白质数为450。成功实现了对大鼠皮质层和纹状体的空间分辨蛋白质组学分析。论文的第三章中,我们利用L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针进行了空间分辨蛋白质组学分析的尝试。我们利用L-赖氨酸作为单体化合物,3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和四甲氧基硅烷(TMOS)共同作为溶胶-凝胶反应前体,制备了杂化硅胶整体材料,采用交联剂戊二醛在整体材料上共价键合胰蛋白酶,获得杂化硅胶整体固定化酶反应器。实验表明这种固定化酶反应器通透性较好,交联度较高,机械强度较高。固定化酶反应器酶解标准蛋白牛血清白蛋白时得到的序列覆盖度高达94.4%,这显示出它对复杂样品的分析有巨大的潜质。这部分工作中,我们成功利用液滴微流控技术制备了 L-赖氨酸硅胶棒,并将其固定到毛细管中,制备了 L-赖氨酸硅胶棒固定化酶探针,但由于硅胶棒孔径较小、采样接触面积较小、且存在较大的采样位阻,无法实现很好的原位酶解采样。论文的第四章总结了本论文的研究工作,对不足之处进行了探讨,并对为了进一步的研究工作进行了展望。