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铜绿假单胞菌是一种条件性感染的人类病原菌,在免疫系统受损的个体中会造成毁灭性的急性和慢性感染。在铜绿假单胞菌中,锌已被证明除了维持正常细胞结构和生理代谢功能外,在毒力发挥、抗生素抗性、宿主感染和定植过程中也发挥重要作用。ZIP（ZRT/IRT-like protein）家族成员是一种广泛存在于生物体中的锌离子转运蛋白,可以从细胞外空间或细胞器中将锌离子转移到细胞质中,后来被证明它还可以转运铁、锰、铜和钴等其他二价金属离子。前期研究中,经过NCBI-BLAST同源搜索比对发现铜绿假单胞菌中PA4467（命名为Zmu T）属于ZIP家族蛋白Zup T的同源蛋白,其氨基酸序列与大肠杆菌的Ec Zup T和支气管败血波氏杆菌的Bb Zup T的一致性高达36.59%和49.59%。使用Phyre2分析其跨膜螺旋,发现膜中Zmu T蛋白含有9个跨膜螺旋（TM1至TM9）且其N末端和C末端分别定位于周质空间和细胞质,这与Ec Zup T和Bb Zup T的拓扑结构存在显著差异。这些结果表明Zmu T可能是一种独特的二价金属离子转运蛋白。因此,本研究主要以铜绿假单胞菌Zmu T转运蛋白为研究对象,通过金属离子对PA4467-PA4471操纵子的调控研究,生长表型分析、金属离子耐受性实验、钙网蛋白（CP）抗性实验、双氧水敏感实验和大蜡螟感染实验,从而对Zmu T蛋白的金属离子转运功能进行分析和鉴定。并进一步通过细菌双杂交实验、蛋白的金属含量分析、生长表型分析和超氧化物歧化酶酶活测定,以检测Zmu T转运蛋白对Sod M和Fum C1活性的影响。结果如下:（1）利用PA4467-PA4471操纵子的启动子与lac Z转录融合的酶活检测分析其表达对二价金属离子的响应,结果表明PA4467-PA4471操纵子的表达受Fe2+和Co2+的抑制。（2）以缺失了三套已知锌离子摄取系统的突变株Δznu BCΔcnt LΔhmt A（命名为PAO1Δ3Zn）的基础上敲除zmu T,以此构建了突变株和遗传互补菌株。通过富锌和限锌条件下对突变株和遗传互补菌株的生长表型分析,结果表明Zmu T可以介导铜绿假单胞菌对锌离子的摄取。（3）异源表达zum T可以显著增强大肠杆菌对Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Co2+和Ca2+等二价金属离子的敏感性,这暗示Zum T转运蛋白可能参与铜绿假单胞菌对这些金属离子的摄取。（4）钙网蛋白（CP）抗性实验、双氧水敏感实验和大蜡螟感染实验等生理表型实验表明,zmu T突变后可显著减弱铜绿假单胞菌对钙网蛋白（CP）和H2O2氧化胁迫的抗性以及对大蜡螟幼虫的毒力。（5）细菌双杂交实验表明,PA4467-PA4471操纵子中Zmu T、Sod M和Fum C1三个蛋白之间存在两两互作关系。并且基因截短实验进一步表明,Zmu T蛋白的C端结构域分别与Sod M、Fum C1蛋白互作,Sod M的C端和Fum C1的N端结构域互作。（6）通过ICP-MS对Fum C1蛋白的金属含量分析,结果显示Fum C1蛋白中结合了钙元素。（7）以野生菌PAO1或PAO1Δsod B作为出发菌株分别,敲除zmu T或sod M构建突变株,并对这些突变株的生长表型和超氧化物歧化酶酶活进行检测。结果表明zmu T缺失突变造成Sod M的功能缺陷,而添加Mn2+则可以恢复Sod M的这种功能缺陷表型。同时,PAO1Δzmu TΔsod B菌株生长水平以及超氧化物歧化酶酶活水平均弱于PAO1Δsod B菌株。这些结果说明Zmu T通过影响Mn2+的摄取而在蛋白水平上影响Sod M的功能。（8）以在富营养培养基TSB中的生长表型探究铜绿假单胞菌中Fum A,Fum C1和Fum C2三种延胡索酸酶的功能,结果表明在生长过程中三种延胡索酸酶均具有活性且功能互补,至少存在一种延胡索酸酶才能维持细菌的正常生长。大蜡螟幼虫侵染实验也表明,延胡索酸酶对铜绿假单胞菌的毒力发挥是必须的,且Fum A、Fum C1在该过程起主要作用。（9）在金属离子匮乏的VBMM培养基中添加不同金属离子时的生长表型分析表明,Fum C1的功能依赖于Ca2+且Ca2+对Fum C1的激活作用对H2O2敏感,这也从功能上进一步证实Fum C1是一个含钙蛋白。（10）以野生菌PAO1或PAO1Δfum AΔfum C2作为出发菌株进一步敲除zmu T或fum C1,通过生长表型分析表明Zmu T通过影响Ca2+的摄取而在蛋白水平上影响Fum C1的功能,暗示Fum C1中Ca辅因子的获得依赖于Zmu T。基于以上的研究结果,我们提出一个Zmu T与Sod M、Fum C1之间功能关联性的分子机制模型:当铜绿假单胞菌侵染宿主时,宿主通过铁限制和产生ROS进行免疫防御。铁限制和ROS使含4Fe-4S的延胡索酸酶Fum A的活性受损,同时使铜绿假单胞菌诱发铁饥饿和氧化胁迫响应,从而激活PA4467-PA4471操纵子的表达,产生Zmu T、Sod M和Fum C1等蛋白。Zmu T将胞外的二价金属离子转运到胞内,并通过蛋白互作分别Mn2+和Ca2+传递给Sod M和Fum C1进而激活它们的功能,以分别替代细胞中因缺铁造成功能缺失的Sod B和Fum A。