目的:本论文通过柴胡皂苷提取物的HPLC-UV色谱图、体外肝细胞摄取HDL细胞模型、细胞筛选活性组分和转录组测序等方法,初步评价柴胡水提皂苷和醇提皂苷的质量情况,并且从“胆固醇逆转运”的角度系统地评价两者的药效作用,为柴胡体外调节脂质代谢进程提供药效的参考依据。根据中医理论的“归经”概念,同时从柴胡皂苷提取物中筛选出作用于肝脏的活性成分,更好地阐明柴胡调肝降脂作用的物质基础。同时在基因转录水平进一步全面地分析柴胡给药前后肝脏细胞的转录水平差异,为柴胡对调节肝脏脂肪病变的作用机制提供科学依据。方法:1.选用柴胡水提皂苷和醇提皂苷作为研究对象,通过纯化后进样分析得到的色谱图,并进行纯化工艺的稳定性、重复性和精密度考察,确定提取物中的主要色谱峰的归属,作为柴胡皂苷提取物的质量参考标准,并为肝细胞固相色谱法筛选活性成分提供完整的成分信息。2.柴胡的水提皂苷和醇提皂苷的主要成分有所差异,利用CCK-8试剂盒考察两者对肝细胞的毒性作用,描绘生长曲线,为药效实验确定安全剂量。基于胆固醇逆转运对脂质代谢的调节作用,采用HepG2细胞摄取DiI-HDL体外模型考察中药柴胡两种提取物对肝细胞摄取HDL环节的影响,比较二者对脂质代谢的药效作用。3.根据药物作用的“靶点”理论,采用细胞膜固相色谱法验证柴胡皂苷提取物的药效作用,并筛选提取物中与肝细胞结合的活性组分。4.通过高脂饲料喂食建立C57BL/6小鼠的高脂模型,测定小鼠肝脏的病理切片,并利用转录组测序技术综合分析柴胡水提皂苷给药后小鼠肝脏基因表达谱的信息,使用泊松分布做差异分析,筛选柴胡给药前后肝脏表达差异显著的基因,并通过文献信息检索从表达差异基因中寻找与脂质代谢相关的基因作进一步的考察。5.采用蛋白免疫印迹技术验证差异表达基因FGF21在蛋白水平的表达情况。结果:1.柴胡水提皂苷和醇提皂苷的色谱图显示,柴胡水提皂苷中的皂苷类型以柴胡皂苷b1和b2为主,柴胡醇提皂苷的主要皂苷成分为柴胡皂苷a和d,说明柴胡的成分与提取方法相关,且纯化方法的重复性、精密度和稳定性良好,可保证提取物的质量稳定可控。2.柴胡皂苷提取物给药24h后,水提皂苷对HepG2细胞的半数抑制率(IC50=48.46 ± 3.15 mg/mL,α=0.05)大于柴胡醇提皂苷(IC50=31.17±0.81 mg/mL,α=0.05),可见柴胡醇提皂苷相比于水提皂苷对肝细胞的毒性较强,更能诱导HepG2细胞凋亡。在给药安全范围内,柴胡水提皂苷可显著促进肝细胞摄取HDL(p<0.05),而其醇提皂苷则呈现抑制作用(p<0.05)。3.柴胡中次生皂苷柴胡皂苷b1和b2可与肝细胞上的特异位点结合,而柴胡原生皂苷类(以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)不被肝细胞膜吸附。4.高脂小鼠经柴胡水提皂苷给药后,脂肪肝病变得到改善,肝脏转录组中存在13个基因表达差异极显著(p<0.0000),包括Gm3776、Cyp2b9、FGF21等,其中Gm3776、Cyp2b9、Lgals1等8个基因在柴胡给药后明显下调,FGF21、Moxd1、G0s2等5个差异基因明显上调。经查阅各个表达差异基因信息,发现FGF21与体内脂质调节作用相关。5.在蛋白表达层面,柴胡水提液可促进FGF21蛋白分泌增加,可能与促进肝摄取HDL的作用机制有关。结论:本论文通过柴胡水提皂苷和醇提皂苷的色谱图,可全面有效地评价对柴胡水提皂苷和醇提皂苷的质量情况;利用CCK-8法对柴胡水提皂苷和醇提皂苷进行毒性评价,通过比较半数致死量(IC50)和生长曲线趋势证明柴胡醇提皂苷对肝细胞的毒性作用较水提皂苷强。体外细胞实验证实柴胡水提皂苷可以提高肝细胞HDL水平,而其醇提皂苷呈现反作用,提示柴胡采用水煎煮可增强柴胡对脂质紊乱相关疾病具有防治作用,为柴胡制剂工艺的改良提供科学依据。细胞膜固相色谱法进一步验证柴胡水提皂苷中的次生皂苷一一柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2可被肝细胞特异性吸附,是潜在的促进肝细胞摄取HDL的有效成分。动物实验证明柴胡水提皂苷可通过上调小鼠肝脏内FGF21的转录水平,增加FGF21细胞因子的分泌,达到改善高脂饮食引起的脂肪肝病变的药效作用。