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桔小实蝇Bactrocera dorsalis又名东方果实蝇,广泛分布于中国各大柑橘产区,使中国的柑橘产业面临着严重威胁,每年都对柑橘为害造成巨大经济损失。除此之外,还可危害柑橘、芒果和杨桃等250多种水果蔬菜和作物。目前化学防治仍是控制桔小实蝇的重要措施,然而化学农药施用的不当,不仅影响果品安全,同时还会导致严重的抗性药。因此,化学防治很难实现桔小实蝇的可持续控制。钠离子通道(sodium channel, SC)基因是拟除虫菊酯类和DDT杀虫剂对昆虫的主要毒害作用靶标；细胞色素P450单加氧化酶系(cytochrome p450monoxygenases,P450s)是一类在结构性质上类似的一族蛋白质,有报道表明,其与昆虫对拟除虫菊酯类和有机氯类杀虫剂的抗性有关。应用RNAi技术可达到昆虫钠离子通道基因和P450基因不能正常表达,从而增强昆虫对农药的敏感性、影响其发育及繁殖,因此可以通过农杆菌介导植物遗传转化和RNAi技术获得抗桔小实蝇材料。本试验将钠离子通道JN416983基因以及P450CYP6EK1基因的特异序列作为靶标序列,构建这两个基因的RNA干扰载体,采用农杆菌介导转化柑橘,旨在获得对桔小实蝇有抗性的新材料。1、RNAi干扰载体的构建NCBI上搜索桔小实蝇钠离子通道基因和细胞色素P450基因全长序列,Blast比对其保守序列,设计特异性的两端加相应酶切位点的引物,构建dsRNA载体。A.载体PFGC5941-C1R1/C2R2的构建：钠离子通道基因正向目的片段与反向目的片段上游下游添加的限制性内切酶分别为XhoI和NcoI、Xbal和BamHI识别序列,克隆得到相应的正向和反向相重复的基因片段。将正向目标基因C1R1质粒进行酶切,同时将载体PFGC5941质粒用相同的两个酶酶切,用T4连接酶将其连接,然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,随机挑选几个单克隆菌落,用通用引物C1R1, PCR检测筛选正确的单菌落,提取质粒,然后酶切验证得到"PFGC5941-正向片段C1R1";将得到的"PFGC5941-C1R1"质粒进行酶切,同时用相同酶对反向目标基因C2R2进行酶切,T4连接酶连接,转入大肠杆菌感受态细胞,随机挑选单克隆菌落,酶切验证,得到载体“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”B.载体PFGC5941-P1F1/P2F2的构建：构建方法同上,在细胞色素P450基因正向目的片段两端分别加上限制性内切酶XhoI和NcoI识别序列；在反向目的片段两端分别加上XbaI和BamHI识别序列,通过双酶切,T4连接酶连接后转入大肠杆菌感受态细胞中,提取质粒,分别进行酶切及PCR扩增验证,最终获得载体“PFGC5941-正向片段P1F1/反向片段P2F2"。2、由农杆菌介导柑橘的遗传转化和转基因植株的验证将上述获得的两个质粒电击法分别转入到农杆菌EHA105菌株。PCR验证后,用含有质粒“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2"的农杆菌侵染锦橙上胚轴,用除草剂Basta进行筛选培养后获得转基因植株。最后长出抗除草剂不定芽15株,利用PFGC5941上携带的BAR基因设计特异引物Ll/R1进行PCR检测,最终获得9株阳性苗。应用与上述相同的方法将含有质粒“PFGC5941-正向片段P1F1/反向片段P2F2"的阳性农杆菌去侵染锦橙上胚轴,用除草剂进行筛选培养后获得转基因植株。长出抗性不定芽12株,利用特异引物L1/R1进行PCR检测,最终获得14株阳性苗。