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自噬是细胞降解部分胞浆,长寿命蛋白质以及细胞器的重要途径之一。它可以通过重新利用细胞内的组分抵抗外界压力促进细胞的增殖与分化。自噬在造血干细胞中的缺失能导致多系血细胞的异常分化,许多血液病尤其是血小板相关疾病伴随着自噬水平的上调,包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)和伴随血小板减少的骨髓异常增生综合征(MDS)。因此,近年来人们开始重视自噬影响巨核细胞增殖分化和血小板生成的研究工作。为了探究自噬对巨核细胞成熟及血小板生成的调节作用,我们主要利用了体外白噬调节剂及动物模型观察巨核细胞和血小板的变化。目的探究自噬紊乱对巨核细胞发育可能造成的影响,影响的具体阶段以及发生机制。方法我们主要通过利用体外自噬流调节药物雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)和体内巨核细胞-血小板上自噬基因Atg7特异性敲除小鼠模型(Atg7flox/flox PF4-Cre)分别造成不同发育阶段的巨核细胞的自噬紊乱和自噬缺失研究自噬对巨核细胞发育的影响。1.体外研究：首先在造血干细胞和成熟的巨核细胞阶段加入雷帕霉素(Rap),巴弗洛霉素(BafA)成功调节早期和晚期巨核细胞内自噬的水平,通过western blot检测经典的自噬小体标记物LC3-Ⅱ的蛋白表达予以确认。然后,结合巨核细胞发育前、后期不同的特点依次检测发育前期巨核细胞的细胞核、细胞质成熟,代表分化程度的膜蛋白CD41与CD61的表达,前血小板的形成,血小板的释放和发育后期巨核细胞产生前血小板的能力。2.体内研究：检测正常生理情况下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠与其同窝对照小鼠Atg7flox/flox的血小板数目,巨核细胞的成熟,以及在低剂量X射线辐照诱导条件下,小鼠获得暂时性血小板减少症之后的血小板恢复情况。3.机制初步探讨：运用western blot 及 Q-PCR的方法检测调控巨核细胞发育相关的分子表达,解释自噬调控巨核细胞发育的可能机制。结果我们在原代分离的小鼠胎肝细胞培养基中加入雷帕霉素(Rap)诱导自噬或巴弗洛霉素(BafA)阻断自噬,我们发现与溶剂对照组(DMSO)相比自噬被调节的两组产生的多倍体巨核细胞数量明显减少(Rap 54.8±0.6%, BafA 50.4±3.8%, Ctrl 71.1 ±2.0%, P＜0.05),同时代表巨核系分化的膜蛋白CD41和CD61表达(Rap1.0±0.1%, BafA 0.7±0.0%, Ctrl 5.2±0.1%, P<0.001)及血小板释放(Rap 0.4±0.3%,BafA 0.7±0.1%,Ctrl 8.5±0.5%,P<0.05)均显著性降低即用雷帕霉素(Rap)或巴弗洛霉素(BafA)调节造血干细胞的自噬能抑制巨核细胞的细胞核的成熟及巨核系的分化。与此同时,我们又检测了不同处理组诱导的巨核细胞内调控整个造血系统发育的转录因子GATA-1和细胞周期相关蛋白CyclinD1, CyclinD2以及P21的表达,我们发现Rap和BafA处理组的胎肝诱导的巨核细胞中GATA-1 (Rap 0.56±0.14, P<0.05; BafA 0.40±0.06, P<0.01), CyclinDl(Rap 0.44±0.03, P＜0.001; BafA 0.68±0.06, P＜0.01), CyclinD2(Rap 0.25±0.03, P＜0.001; BafA 0.35±0.02, P<0.05)以及P21(Rap 0.04±0.02, P<0.05; BafA 0.04±0.02, P<0.05)的表达均比对照组(GATA-1:Ctrl 1.15±0.13; CyclinD1:Ctrl 1.0±0.07; CyclinD2:Ctrl 0.49±0.03; P21: Ctrl 0.16±0.03)有显著性降低；接着我们又检测了磷酸化的肌球蛋白轻链(P-MLC),发现Rap处理组MLC磷酸化水平与对照组相比有显著性的增高并且该组的巨核细胞的大小也降低,但是我们在BafA处理组中并未发现MLC磷酸化水平和细胞大小的改变即雷帕霉素或巴弗洛霉素能影响胎肝来源的巨核细胞周期相关蛋白Cyclin D1, CyclinD2以及P21,转录因子GATA-1的表达及MLC的磷酸化水平。然而,我们在巨核细胞纯化之后再在其培养基中加入Rap或BafA调节自噬,发现前血小板生成未出现异常,这与我们在巨核细胞-血小板自噬基因Atg7特异性敲除小鼠Atg7flox/flox PF4-Cre体内观察到的正常血小板计数和巨核细胞成熟的表型相符,同时自噬基因Atg7特异性敲除并不影响小鼠抵抗低剂量X射线辐照的血小板恢复情况。综上所述,我们的实验表明在早期造血干细胞阶段对自噬进行干预调节能抑制巨核细胞发育及血小板的生成,提示我们该阶段可能是治疗血小板减少的相关疾病潜在的靶点。结论在造血干细胞阶段上调或者下调自噬能抑制巨核细胞发育的整个过程,巨核细胞的成熟受抑制会进一步影响血小板的最终生成。自噬对巨核细胞发育的调控主要通过对转录因子GATA-1,细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinD2、 P21以及RhoA下游分子MLC的磷酸化调节实现的。在成熟的巨核细胞阶段干扰自噬不会影响巨核细胞产生前血小板,巨核系自噬基因敲除造成的自噬缺失并不影响巨核细胞的发育以及小鼠抵抗外界低剂量射线辐照的血小板恢复。