蛋白质组学是大规模、高通量、系统化研究某种细胞、组织或生物体中所有蛋白质的组成及其功能的学科。翻译后修饰对蛋白质的功能和活性起至关重要的作用，因此，蛋白质组学研究不仅包括蛋白质的定量、定性分析，还包括蛋白质的修饰种类和修饰位点鉴定。目前常见的蛋白质组学研究策略有两种：“Top-down”和“Bottom-up”。“Top-down”以完整蛋白质为研究对象，通过对完整蛋白质分子质量的测定和碎裂谱图的解读，实现对其序列覆盖率100％的测定。“Bottom-up”是目前应用最为广泛的蛋白质组学研究策略，它的流程是将复杂的蛋白质样品酶解成肽段，再通过色谱等方法将其分离后，进一步使用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）进行分析，通过碎裂谱图与蛋白质数据库的匹配情况来鉴定肽段，从而获得相应蛋白质的信息。该策略非常适用于大规模分析鉴定复杂蛋白质组样本。近几十年来，质谱技术不断发展，尤其是生物质谱广泛应用于蛋白质的分析鉴定，为蛋白质组研究提供了高通量、快速、精确、灵敏的检测方法。随着蛋白质组学研究不断深入，应用也愈发广泛。通过对生命活动过程中蛋白质的表达、修饰和功能调节机制的异常进行蛋白质组研究，人们能够深入认识生命的生理过程和病理变化，从而期诊断和预后提供分子标志物。　　酪氨酸磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰已成为近年来组学研究的热点领域。酪氨酸磷酸化及其激酶参与调控多个重要的生物过程，包括细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、血管生成、细胞迁移、基因转录和代谢反应等。它是细胞信号转导中的关键因子，且在肿瘤的发生发展中起到关键性作用。酪氨酸磷酸化及其激酶活性的研究在抗肿瘤药物靶点的研发中具有十分重要的意义。然而，由于酪氨酸磷酸化仅占蛋白质总磷酸化含量的不足0.1%，因此规模化的酪氨酸磷酸化鉴定面临着重大技术挑战。常见的酪氨酸磷酸肽富集方法主要有金属氧化物亲和色谱和抗酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀。然而，这两种方法均存在一定缺陷。二氧化钛无偏性地将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸肽富集出来，往往鉴定结果中仅含有1%~2%的酪氨酸磷酸肽，大量的非酪氨酸磷酸肽在质谱检测时会抑制酪氨酸磷酸肽的信号；抗体免疫沉淀的方法虽然是针对酪氨酸磷酸肽特异性富集的方法，但应用于复杂样品时，由于样品的高度复杂性和抗体亲和力的有限性，导致抗体富集时也会存在大量非特异性吸附肽段。针对这些难题，我们建立了一种先以二氧化钛富集磷酸肽，再以抗体富集酪氨酸磷酸肽的富集策略。我们发展了一种用于磷酸肽富集的新型离心式富集装置，该装置使二氧化钛串联反相填料，将磷酸肽的富集、清洗、洗脱和分离通过自制的离心装置集成一体。在此基础上，结合抗体免疫沉淀建立了酪氨酸磷酸肽的富集新策略。该富集装置简化了实验步骤，减少了样品损失和人为因素干扰；而且离心式、平行化的样品处理方式可显著提高分析通量。为了得到了最优的富集方法，我们对这种策略的实验条件进行细致的考察和优化。首先是磷酸肽富集方法的优化，在离心式富集装置的基础上，我们考察了包括酶切肽段与TiO2的质量比，洗脱液的乙腈比例，结果表明，当酶切肽段与TiO2的质量比为1:4，洗脱液乙腈比例分别为2%、5%、8%、10%、40%时，富集效果较好。1 mg鼠肝蛋白中可鉴定到磷酸化位点10793个，对应7333个磷酸化修饰肽段。在此基础上，我们研究了抗体富集实验条件，包括不同公司的抗体，起始蛋白量，抗体清洗方式等。我们将优化后的策略成功用于小鼠肝脏蛋白质酪氨酸磷酸化肽段的富集和质谱鉴定，共计鉴定849个酪氨酸磷酸化肽，对应545个蛋白质，其蛋白功能与文献报道的已知酪氨酸磷酸化修饰蛋白功能相符。这为深入研究酪氨酸磷酸化修饰提供了有力支持，显示了该富集策略在蛋白质组学研究中的应用潜力。　　肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌。大多数肝癌患者在确诊时已失去手术切除的机会，因此寻找有效的肝癌药物治疗靶点以及早期诊断的标志物具有重要意义。运用蛋白质组学研究方法，比较正常和病理状态下的肝癌细胞或组织中酪氨酸磷酸化蛋白的表达和修饰量的差异，对发现肿瘤相关特异性靶点具有重要意义，可为肝癌的临床诊断、病理研究、药物靶点筛选提供理论依据和基础。　　我们以小鼠肝脏为样品建立的酪氨酸磷酸肽富集策略应用于人的肝癌组织和其癌旁组织的酪氨酸磷酸肽富集与鉴定。从77例肝癌病人的癌组织中共鉴定到970个非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白，1492个酪氨酸磷酸化位点；从癌旁组织中鉴定到962个非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白，1424个酪氨酸磷酸化位点。这一数据有助于深入研究酪氨酸磷酸化修饰在肝脏生理病理过程中的调节机制。本实验也进一步证明自制的离心式富集装置和抗体结合的酪氨酸磷酸肽富集策略可以应用于复杂临床样本，该装置在其他蛋白质翻译后修饰的富集与鉴定中也有良好的应用潜力。