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脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs）是具有多向分化潜能的成体干细胞。在严重的创伤性疾病、自身免疫病、代谢性疾病和退行性疾病等多种疾病模型中，ADSCs 移植都能表现出良好的治疗效果。另外，由于其获取方便，没有伦理道德争议，没有致瘤性，取材对机体损伤较小等优点使其成为干细胞治疗的理想种子细胞和研究热点。在兽医临床中，犬的ADSCs移植也具有广阔的应用前景。但是由于ADSCs移植前体外富集扩增的过程不可避免的会引起细胞的衰老，影响移植存活率和治疗效果。而褪黑素（Melatonin，Mel）在多种动物、细胞模型中都被报道具有调节生物节律，抗氧化和抗衰老的作用。因此，本研究以体外多次传代衰老的cADSCs为模型，针对Mel抗ADSCs衰老的作用效果，Mel介导内质网应激延缓cADSCs衰老的机制开展了研究，获得以下研究结果： 1. 体外多次传代可以造成 cADSCs 衰老，且 Mel 能通过降低 ERS 缓解cADSCs衰老。通过衰老相关β半乳糖苷酶染色、体外诱导分化试验、端粒相对长度和端粒酶活性检测、real-time PCR和western blot等方法对细胞衰老表型和ERS水平进行检测，发现cADSCs体外传代P11代左右出现衰老相关β半乳糖苷酶染色阳性率显著升高，端粒酶活性显著降低，分化潜能降低，P16蛋白水平升高等明显的衰老表型，及 ERS 显著升高的现象；通过分别在体外培养体系中添加Mel、ERS抑制剂4-PBA和激活剂TM，发现Mel能缓解cADSCs的衰老表型，降低ERS水平；4-PBA能抑制cADSCs衰老表型，而TM则促进cADSCs的衰老表型。试验结果说明Mel能通过抑制ERS缓解cADSCs衰老。 2. Mel能激活cADSCs中Nrf2基因的节律性表达。用real-time PCR检测体外传代造成的衰老对cADSCs生物钟相关基因Per2和Bmal1，抗衰老相关基因Nrf2和ERS相关基因Grp78表达动态变化的影响，发现高代次cADSCs与低代次cADSCs相比，Per2、Bmal1、Nrf2和Grp78等基因表达的节律性丧失；通过向体外培养体系中添加Mel，发现Mel可以激活Bmal1、Nrf2和Grp78基因的节律性表达，提高MT1/MT2蛋白水平；而与Mel处理组相比，额外添加Mel受体MT1/MT2的抑制剂Luzindole使Bmal1、Nrf2的表达量下降且节律性表达振幅减小，说明Mel可能通过受体MT1/MT2途径调节生物钟相关基因和Nrf2的节律性表达。 3. Mel能激活cADSCs的Nrf2和内质网相关蛋白降解途径（ER-associated degradation，ERAD）抑制ERS。用real-time PCR、双荧光素酶报告基因试验、免疫荧光染色、western blot检测等方法，发现Mel处理能激活Nrf2基因表达且促进 NRF2 入核发挥转录因子功能，升高 ERAD 相关基因和蛋白的表达量；通过向培养体系中添加Mel受体MT1/MT2抑制剂Luzindole和激活剂Ramelteon，发现Luzindole抑制Nrf2的活性，而Ramelteon激活了Nrf2的活性。干扰Nrf2能阻碍 Mel 对 ERAD 相关基因表达的激活作用；而 ERAD 抑制剂 MG132和NMS-873处理能阻碍Mel对ERS的抑制作用。试验证明Mel能通过MT1/MT2受体途径，激活Nrf2，活化ERAD，抑制cADSCs的ERS。 4. Mel能通过激活Nrf2抑制cADSCs的NF-κB信号通路和衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype，SASP）。利用Mel、Luzindole和Nrf2激活剂Oltipraz处理cADSCs，通过real-time PCR、双荧光素酶报告基因试验和western blot检测发现，Mel和Oltipraz能抑制NF-κB信号通路和SASP，而Luzindole能阻碍Mel的抑制作用；另外，利用Mel处理cADSCs的shNrf2干扰细胞株，发现干扰Nrf2阻碍Mel对SASP和NF-κB的抑制作用。试验证明Mel能通过MT1/MT2受体途径激活cADSCs的Nrf2，抑制NF-κB信号通路和SASP。 5. Mel预处理能提高cADSCs移植治疗犬急性肝损伤的疗效。利用腹腔注射CCl4构建犬的急性肝损伤模型，分别取 Mel预处理和未处理的cADSCs进行细胞移植，通过采食饮水、血清生化、组织冰冻切片和石蜡切片HE染色等检测，发现Mel预处理的cADSCs移植存活率更高，治疗效果更理想。 综上所述，本研究构建了 cADSCs 的体外传代衰老模型，探索了 Mel 对cADSCs的抗衰老作用机制，证明Mel能通过受体MT1/MT2途径激活Nrf2，活化ERAD，抑制NF-κB，抑制ERS，缓解cADSCs的衰老，并通过犬急性肝损伤模型的 cADSCs 移植验证了 Mel 抗 cADSCs 衰老的作用效果。本研究为推动cADSCs在兽医临床的应用提供了理论依据和技术参考。