侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特性，肿瘤细胞实现侵袭和转移必须穿越基底膜和细胞外基质(extracellular matrix ECM)。硫酸乙酰肝素(heparansulfate HS)是ECM的重要组成成分，还是许多生长因子、细胞因子的贮存位点。肿瘤细胞能够产生近年新克隆的Heparanase，特异性降解HS，从而使肿瘤细胞更易于穿越ECM，还能够释放HS结合的多种生长因子、细胞因子，促进肿瘤的生长、粘附、血管生成。更加引入瞩目的是，Heparanase是哺乳动物唯一能够降解HS的内切糖苷酶，因此研究Heparanase与肿瘤转移的关系显得尤为重要，成为肿瘤转移研究领域的焦点。 本研究采用分子克隆技术，克服人Heparanase基因ORF区前后两端存在天然互补碱基的困难，利用该基因ORF区及载体pcDNA 3.1／Myc-His(-)B中均含有BamH Ⅰ酶切位点的特点，设计含有限制性酶切位点的两对引物，分别PCR扩增得到Heparanase BamH Ⅰ前后两部分，再连接成完整的Heparanase基因。成功构建了正、反义人Heparanase基因真核表达载体，限制性内切酶酶切结果与预计完全相符，测序证实与GenBank登录的人Heparanase基因ORF区碱基序列(AF144325)完全一致，而且读框正确，可用于正确表达；脂质体法将正、反义人Heparanase一基因稳定转染于人肝癌细胞系HepGZ和高转移人肝癌细胞系HCCF，空载体作为对照，G418选择性培养 60d，获得阳性细胞克隆；半定量 RTICR＿证实转染正义载体的HapGZ和HCCI在Haparanase基因InRNA表达水平均明显高于对照组及反义组，而转染反义载体则明显抑制Heparanase基因m枷A的表达；免疫组织化学进一步证实Heparanase蛋白高效、稳定表达于转染正义载体的HepGZ和HCCI细胞浆、细胞膜并分泌至细胞间隙，反义组和对照组均为阴性；细胞生长曲线、MTh实验表明转染正、反义基因对细胞生长无明显影响。从而获得了高效表达Hoparanase基因和抑制Hoparanase基因表达的理想实验细胞株。 采用裸鼠尾静脉注射上述转染细胞建立肝癌血行性转移模型，30d后取出肺脏，称量肺脏重量及计数肺表面转移结节均表明Hoparanase基因可以明显促进肝癌细胞转移，而应用反义技术则显著抑制转移的发生（叼刀1）；比较两种不同转移潜能的细胞亦发现，高转移肝癌细胞＊＊＊F较＊ep＊2更易出现转移厌 刀1）：肺脏标本常规石蜡包埋、切片、＊E染色，表明注射转染正义基因肝癌细胞的裸鼠肺脏有大量转移灶，而反义组仅见少量小转移灶。揭示了稳定转染并表达Haparanase基因的肝癌细胞更易于发生转移，而反义载体可以通过抑制Hoparanase基因的表达，发挥明显的转移抑制作用，具有潜在的临床应用前景。 将正义Haparanase基因亚克隆于原核表达载体pRSET（），转化表达型大肠杆菌BLZI菌株，IPTG成功诱导产生Hoparanase蛋白，作为抗原免疫新西兰兔，成功制备了高效价、高特异性和高亲和力的抗Hoparanase多克隆抗体，低幻inN。dng检测抗体效价为1：200o：应用制备的抗体，采用免疫组织化学技术检测25例肝癌组织内Hoparanse蛋白的表达情况，其阳性表达与肿瘤大小、肝内转移、肿瘤包膜侵犯显著相关o叼．05〕 而与AFP水平、HBV阳性、HCV阳性、病理分级无关；应用敏感性高、特 一4一一异性强的半定量RT－PCR技术，检测20例肝癌及相应癌旁组织内Heparanse基因mRNA的表达，以B－acin为内参照，结果表明20例肝癌患者中有15例门5％）检测到＊＠ m聊表达，癌旁组织仅有6例臼0％）检测到表达，其表达值… fq显著低于肝癌组织c5．56％土6．58％对71．49O上5．slO，P功．001卜通过免疫组织化学和半定量RTFCR检测肝癌和癌旁组织内Heparanse基因蛋白和mRNA水平的表达，具有类似的结果，即在涉及到肝癌生长、浸润、转移方面的特征如肿瘤大小、包膜侵犯、肝内转移方面均有显著意义（P＜刀5X不但表明制备的兔抗人Heparanase多克隆抗体的可应用性，更重要的是证实肝癌细胞高表达Heparanse基因，明显促进了肝癌的生长、浸润和转移。