【摘 要】
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大豆蛋白是为生物提供营养的重要来源,对其潜在营养健康益处的开发需要我们在亚基水平开展研究。对大豆分离蛋白的不同亚基进行分离,受到纯化柱材费用高、人工耗时长、制备量小且纯度低等问题的限制,然而在分子水平探究不同亚基的功能是研究的前沿,为解决7S大豆球蛋白不同亚基制备难度较大,且无法大量获得的问题,本研究选用“齐黄34”大豆,对其7S大豆球蛋白α-亚基进行原核表达;采用亲和层析方法,通过蛋白纯化系统获
【基金项目】
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陕西省重点研发计划（编号:2018NY-122）；
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大豆蛋白是为生物提供营养的重要来源,对其潜在营养健康益处的开发需要我们在亚基水平开展研究。对大豆分离蛋白的不同亚基进行分离,受到纯化柱材费用高、人工耗时长、制备量小且纯度低等问题的限制,然而在分子水平探究不同亚基的功能是研究的前沿,为解决7S大豆球蛋白不同亚基制备难度较大,且无法大量获得的问题,本研究选用“齐黄34”大豆,对其7S大豆球蛋白α-亚基进行原核表达;采用亲和层析方法,通过蛋白纯化系统获得纯度较高的目的蛋白。具体研究结果如下:提取出大豆总RNA,采用PCR方法扩增出7S大豆球蛋白的α-亚基基因序列,将其克隆至p GEM-T Easy载体上,将其命名为p GEM-T Easy-α;再将p GEM-T Easy-α载体上的7S大豆球蛋白的α-亚基基因序列酶切回收连接到p ET-28a表达载体,将其命名为p ET-28a-α。将p ET-28a-α表达载体导入大肠埃希菌BL21（DE3）获得阳性克隆菌株p ET-28a-α-BL21。经不同条件组合进行表达优化,重组α-亚基蛋白在菌液浓度(OD600值)达到0.6,30℃诱导培养9h内高水平增长,得到的胞内目的蛋白为大肠杆菌表达总蛋白的25.83%。此条件相较于大多数研究采取的37℃、菌液浓度(OD600)0.8、诱导培养9h,蛋白纯度提高10%～15%。用筛选出的条件诱导表达重组7S大豆球蛋白α-亚基蛋白,经电泳检测其分子量在70 k Da左右。先进行线性洗脱,确定α-亚基蛋白的出峰位置在咪唑体积分数为70%左右,由于蛋白电泳检测结果表明掺杂其他蛋白,因此采用双浓度分步洗脱,提高蛋白纯度。试验最终采用的纯化条件为通过含有350 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液对镍亲和层析柱进行洗脱,可以获得纯度达70.0%左右的重组蛋白α-亚基,且重量达毫克级别。本试验为后期研究7S大豆球蛋白α-亚基的结构及理化性质打下基础。
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