背景与目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种异质性很强的造血系统恶性肿瘤,不同AML患者其生物学行为和预后可以表现很大不同。随着化疗等治疗手段的改善,目前60%-80%的AML患者经标准化疗后可以获得完全缓解(complete remission,CR),但即使获得CR后通过巩固治疗、定期强化和维持治疗,无病生存率仍徘徊于40%-50%左右,多数患者由于对抗白血病药物产生多药耐药而使治疗失败。目前研究表明要进一步提高AML的疗效的途径之一是进行分层及个体化治疗。研究发现遗传学改变是初诊AML的主要预后因素,根据遗传学异常可以将AML划分为低、中、高危3个组,对指导临床治疗发挥重要作用。但临床实践发现遗传学分层并不能完全满足临床需要。通过SNP、基因芯片等技术已证实,许多基因突变和基因表达异常与AML的预后相关,目前发现具有CEBPA、NPM1基因突变的AML预后较好,而FLT3突变、MLL突变、P53突变和WT1突变的正常核型AML预后则较差。伴有BAALC、ERG及MN1等基因高表达的正常核型AML预后也较差。因而根据细胞遗传学和分子遗传学诊断与预后分析,采取分层和个体化治疗相结合的手段,将进一步提高白血病治疗效果。难治和复发是导致急性白血病治疗失败的最根本原因,目前认为多药耐药(Multipledrug resisitance, MDR)是导致白血病难治和复发的重要因素之一。人类MDR基因家族中主要是MDR1基因和白血病的多药耐药现象相关,MDR1基因编码P170糖蛋白可将进入白血病细胞药物泵出细胞外,导致耐药的产生。BAALC (brain and acute leukemia, cytoplasmic)基因定位于染色体8q22.3,最初被发现在神经外胚层组织中表达。自2001年STEPHAN等首次报道检测到造血前体细胞中BAALC基因的表达以来,随后的研究提示该基因在白血病中出现异常高表达,尤其是在正常核型急性髓系白血病(NC-AML)[2-5]和T-ALL中[6],是一独立的提示预后不良的分子指标,在指导白血病治疗方面起着重要的作用。为深入探讨MDR1和BAALC两种不同的基因在白血病难治和复发中的作用及相互关系,利用了目前准确性和特异性均较好的实时荧光定量PCR技术(Real-time quatitative PCR, RQ-PCR),检测160例初治AML患者MDR1和BAALC基因表达水平,通过单独检测和联合检测,判断二者中对预后的指导价值哪个更为重要及联合检查是否会进一步提高临床指导意义。方法：1、培养KASUMI-1细胞,提取总RNA,选用GAPDH为内参基因,针对MDR1、BAALC及GAPDH mRNA设计引物,RT-PCR扩增目标片断,PCR产物纯化后转化到T载体,构建含目标片段的质粒,做为阳性定量标准模板的克隆。2、克隆的阳性定量标准模板按106,105,104,103,102,101copies/μl梯度稀释,在荧光定量PCR仪分别进行PCR反应,同时验证MDR1、BAALC、GAPDH三者扩增效率是否一致。3、研究对象：经细胞形态学、组织化学染色及流式细胞术免疫学分型确诊的160例初治AML患者。4、提取AML患者骨髓标本,提取总RNA,逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测。每份标本均进行3个重复检测,最后CT值取其均数。为排除RNA浓度对扩增效率的影响,MDR1和BAALC mRNA表达水平采用的相对表达量来表示,即采用2—ACT值(ACT=MDR1/BAALC-GAPDH;2-ACT=2GAPDH-MDR1/BAALC)来表示MDR1和BAALC的相对表达量,并分析MDR1和BAALC表达水平与FAB分型、临床特征、疗效和预后关系。5、计量资料用均数±标准差表示;不服从正态分布的两组计量资料间分布比较用Mann-Whitney U检验；两组以上计量资料间分布比较用Kruskal-Wallis检验；多重比较用Bonferroni法；两变量间相关性采用Spearman秩相关分析;率的比较采用卡方检验；方差齐的两独立样本检验用两独立样本t检验；生存分析采用Kaplan-Meier法；不同生存曲线的差异采用log-rank检验。所有检验以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、160例AML骨髓标本中MDRl基因表达量中位数为0.016(0～81.865),BAALC基因表达量中位数为0.012(0～59.507)。统计学分析显示160例初治AML患者MDR1基因表达量与BAALC基因表达量相关关系有统计学意义,且为正相关(r=0.351,P<0.001)2、初治AML患者中MDRl和BAALC基因高表达组与低表达组比较在年龄、性别、FAB亚型、外周血WBC、HGB、PLT、外周血及骨髓原始幼稚细胞比例差异均无统计学意义(P均>0.05)。3、160例初治AML患者经诱导化疗后,113例获得首疗程完全缓解(CR), CR率为70.6%,MDR1基因高表达组的CR率(61.3%)与低表达组的(80.0%)比较差异有统计学意义(P=0.009)；BAALC基因高表达组的CR率(64.2%)与低表达组的(77.2%)比较差异无统计学意义(P=0.072)。对初治获得缓解的113例AML患者进行随访,发现38例复发,复发率为33.6%。其中MDR1基因高表达组复发率(46.9%)高于MDR1低表达组(23.4%),差异有统计学意义(P=0.009)；BAALC高表达组复发率(40.4%)与低表达组(27.9%)比较差异无统计学意义(P=0.160))。使用Kaplan-Meier分析方法对AML患者进行生存分析,随访截止日期为2010年9月30日,MDR1高表达组中位生存时间为437天,低表达组中位生存时间553天。MDR1高表达组总生存率低于MDR1低表达组,差异有统计学意义(32.5% vs.56.3% P=0.007)。BAALC高表达组中位生存时间为454天,低表达组中位生存时间787天。BAALC高表达组总生存率与低表达组相比较差异无统计学意义(37.0% vs.51.9%,P=0.057)。4、联合检测两个基因表达水平与AML预后关系,发现MDR1(?)(?)BAALC均低表达组CR率高、复发率低、总生存率高,提示较好的预后,其次分别为MDR1低表达且BAALC高表达组、MDR1高表达且BAALC(?)(?)表达组和MDR1和BAALC均高表达组,差异有统计学意义(P=0.023,0.031和0.023)。进一步两两比较发现,MDR1(?)(?)BAALC均低表达组与MDR1和BAALC均高表达组相比较,CR率、复发率和OS差异均有统计学意义(P=0.004,0.006和0.002),MDR1(?)(?)BAALC均低表达组CR率最高、复发率最低、总生存率最高。MDR1低表达且BAALC高表达组CR率高于MDR1和BAALC均高表达组,差异有统计学意义(P=0.034),前者复发率与后者相比也有统计学差异(P=0.029),但OS比较差异无统计学意义(P>0.05)。MDR1和BAALC均低表达组与MDR1高表达且BAALC低表达组在OS方面的差异也有统计学意义(P=0.048)。余各组CR率、复发率和OS比较均无统计学意义(P值均>0.05)结论：1、MDR1基因高表达的AML患者,CR率低,复发率高,总生存期短,提示较差的预后。2.BAALC基因高表达的AML患者,虽然同低表达组比较在CR率、复发率和OS方面有较差的结果,但差异无统计学意义。3、联合检测MDR1和BAALC基因表达水平,结果显示二者均高表达组CR率最低,复发率最高,预后最差；二者均低表达组预后最好,提示联合检测更具有临床意义。4、单独检测时MDR1基因高表达对初治AML的预后意义高于BAALC基因。无论BAALC高表达或者低表达,只要检测到MDR1基因的高表达,即提示较差的预后。