目的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的始动环节。本课题首先在复制细胞氧化应激损伤模型的基础上,研究六味地黄方（LWDHF）含药血清对内皮细胞的保护作用;采用siRNA干扰方法研究ERα在LWDHF内皮保护中的作用;利用荧光共振能量转移技术筛选LWDHF中与雌激素受体结合的成分,寻找LWDHF中调控雌激素受体的有效成分;ER基因甲基化导致ER表达异常,心血管疾病风险增加,通过研究LWDHF对ER基因甲基化的影响,试图阐明其内皮细胞保护作用的机制。方法采用浓度为400μmol/L的H₂O₂复制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤模型,分别观察LWDHF含药血清对HUVECs的作用;模型复制成功后,MTT法检测细胞增殖率,Hoechst染色观察细胞核凋亡形态,电镜观察细胞超微结构,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot技术检测凋亡相关基因（Bax、Bcl-2和Caspase-3）mRNA和蛋白表达,试剂盒检测细胞上清液NOS和NO的含量;Western blot和RT-PCR技术检测ERα和ERβmRNA和蛋白表达;荧光共振能量的转移技术筛选LWDHF中结合雌激素受体的相关成分。采用siRNA干扰技术沉默ERα之后观察LWDHF含药血清对细胞的凋亡作用,采用Western blot检测Bax和Bcl-2表达;免疫荧光观察细胞凋亡和相关蛋白的表达情况。采用ELISA法检测更年期AS模型大鼠血清Hcy含量,Western blot检测主动脉DNMTs表达;Hcy复制内皮细胞损伤模型,评价LWDHF含药血清对内皮细胞增殖和ERα、DNMT1蛋白表达的影响。结果1、LWDHF含药血清对损伤后HUVECs增殖和形态学的影响1.1 MTT法:LWDHF含药血清能促进H₂O₂损伤的HUVECs增殖,5%、10%及20%的含药血清对HUVECs的保护率分别为31.18%、41.92%及71.39%。1.2流式细胞仪检测:H₂O₂损伤引起内皮细胞G1期细胞增多,G2、S期细胞减少。加入5%、10%及20%LWDHF含药血清后,进入S、G2期的细胞明显增多,呈剂量依赖性,与H₂O₂组比较（除5%和10%LWDHF组的G2期外）均有显著性差异（P<0.05）。当LWDHF含药血清为20%时,细胞周期接近正常对照组。1.3透射电镜观察:H₂O₂损伤后,血管内皮细胞肿胀,核染色质部分溶解,粗面内质网囊状扩张,线粒体嵴融合变性,溶酶体增加,微丝团于胞质中央,细胞几近死亡;细胞表面微绒毛消失,呈光滑状,细胞核有内陷。胞质内大部分线粒体内外膜及嵴融合,结构异常,并见大量溶酶体;粗面内质网扩张,膜溶解,形成透明泡状。线粒体内外膜融合,嵴融合呈球形或不规则形。LWDHF含药血清作用后血管内皮细胞表面有较多短小、纤细的微绒毛,细胞核及核仁结构完好,染色质均匀,线粒体较小而暗,仅有少部分粗面内质网轻微扩张;细胞表面光滑缺少微绒毛,紧密连接结构完好,细胞核及大部分细胞器结构完好。2、LWDHF含药血清对损伤后HUVECs凋亡的影响2.1Annexin V-FITC/PI双染:H₂O₂作用24h后,细胞凋亡率显著上升（P<0.01）。给药组加入5%、10%及20%LWDHF含药血清后,各组凋亡率与H₂O₂组比较均下降（P<0.01）。2.2Hoechst染色:H₂O₂作用后荧光颜色较对照组明显变亮,细胞核呈现典型的凋亡形态学变化,包括致密浓染或呈碎块状致密浓染,核边缘化等,细胞数量也明显减少。加入LWDHF含药血清后均可明显改善H₂O₂诱导的凋亡形态学变化,细胞核形态均一,荧光较强的细胞减少,细胞数量随着浓度的增加而增多。2.3激光共聚焦:H₂O₂可引起HUVEC钙超载,引发细胞损伤,H₂O₂组荧光强度明显增加,20%LWDHF含药血清能缓解H₂O₂所致的钙超载,使胞内钙明显下降,接近正常情况下的钙水平。3、LWDHF 含药血清对 HUVECs Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 的影响3.1RT-PCR检测mRNA水平:H₂O₂组Bax、Caspase-3mRNA表达与对照组相比均升高（P<0.05）,而 Bcl-2 mRNA 表达显著降低（P<0.01）;20%LWDHF 含药血清能升高 Bcl-2 mRNA表达,降低 Bax、Caspase-3 mRNA 表达（P<0.05）。3.2 Western blot 检测蛋白水平:H₂O₂组 Bax、Caspase-3 蛋白表达均升高（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05）;20%LWDHF含药血清处理后Bcl-2蛋白表达有升高趋势,且Bax、Caspase-3蛋白表达均降低（P<0.05）。4、LWDHF含药血清对HUVECs NOS和NO的影响4.1试剂盒检测HUVECs上清iNOS含量:内皮细胞经H₂O₂刺激后iNOS含量明显升高（P<0.01）,LWDHF含药血清能降低iNOS含量（P<0.05）;LWDHF含药血清中加入Tamoxifen之后,LWDHF含药血降低iNOS的作用被部分阻断（P<0.01）。4.2试剂盒检测HUVECs上清eNOS含量:经H₂O₂损伤后的内皮细胞组eNOS含量显著降低（P<0.01）;LWDHF含药血清能升高内皮细胞eNOS含量（P<0.05）;比较LWDHF含药血清+Tamoxifen组与LWDHF含药血清组,Tamoxifen能降低LWDHF含药血清升高eNOS的作用（P<0.05）。4.3试剂盒检测HUVECs上清NO含量:经H₂O₂刺激损伤后的细胞NO生成明显增加（P<0.01）;LWDHF含药血清能使细胞NO释放量减少,LWDHF+Tamoxifen组与LWDHF组相比细胞NO释放量增多（P<0.01）。5、LWDHF对ERα和ERβ的影响5.1 RT-PCR检测mRNA水平:H₂O₂组ERα mRNA和ERβ mRNA表达分别降低,与对照组相比具有显著性差异（P<0.01）;20%LWDHF含药血清干预后ERα mRNA和ERβ mRNA均升高,与H₂O₂组相比具有显著性差异（P<0.01）。5.2 Western blot检测蛋白水平:H₂O₂组ERα、ERβ蛋白表达均降低,与对照组相比均有显著差异（P<0.01）;20%LWDHF含药血清处理后ERα、ERβ蛋白表达明显升高,与H₂O₂组相比有显著性差异（P<0.05）。5.3雌激素受体调节剂筛选:雌激素受体结合率较高的部位主要集中在地黄、丹皮、泽泻、山茱萸的石油醚/乙醇提取物中,以苷类、酚类等成分为主。单体筛选结果显示梓醇与ERα结合率较高,桃叶珊瑚苷、二氢梓醇和马钱苷与ERβ的结合率较高,并具有量效关系。6、ERα介导的LWDHF内皮细胞保护作用6.1 ERα siRNA转染后Bax和Bcl-2表达:内皮细胞在转染ERα siRNA之后ERα表达被抑制,同时发现Bax表达增加,Bcl-2表达减少,H₂O₂处理转染后的细胞,LWDHF含药血清干预并不能改变Bax和Bcl-2蛋白表达水平,虽有一定趋势,但统计学均没有差异。6.2细胞免疫荧光:内皮细胞在转染ERα siRNA Bax蛋白水平有所增加,Bcl-2表达水平下降,与此同时细胞数量也减少,并且LWDHF含药血清干预并不能改变ERα表达被抑制后内皮细胞的Bax和Bcl-2蛋白水平,也不能明显改善细胞凋亡状态。7、LWDHF对更年期AS大鼠Hcy和DNMTs的影响7.1血清Hcy含量:更年期AS模型大鼠血清Hcy水平相比对照组明显升高;LWDHF治疗组大鼠血清Hcy水平接近正常组水平;熟地/泽泻、山茱萸/丹皮、山药/茯苓三个药对均有作用,其中熟地/泽泻药对效果最佳,其次是山药/茯苓药对;苯甲酸雌二醇对血清同型半胱氨酸水平也具有明显的调节作用,可基本恢复至正常水平。7.2主动脉DNMTs蛋白表达:高脂喂养后的去势雌性大鼠主动脉DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达水平均明显升高,LWDHF和三个药对治疗组均可降低主动脉DNMT1和DNMT3a蛋白表达水平。LWDHF及其三个药对均对DNMT3b没有明显的干预作用;另外比较了雌二醇对DNMTs的调节作用,结果可见雌二醇均能显著降低模型组大鼠主动脉DNMTs蛋白表达水平。8、LWDHF对Hcy介导的ERα基因甲基化的影响8.1 HUVECs活力:HUVECs暴露Hcy增殖受到明显抑制,LWDHF含药血清干预后细胞增殖率上升,熟地/泽泻、山茱萸/丹皮、山药/茯苓药对含药血清均能升高细胞增殖率;雌二醇干预组也具有明显效果,相比较LWDHF含药血清的效果要优于雌二醇。8.2 ERα蛋白表达:Hcy处理过后的HUVECs发现ERα表达水平显著降低,LWDHF含药血清干预后的细胞ERα表达水平上升,熟地/泽泻、山茱萸/丹皮药对含药血清均有上调ERα表达的作用;雌二醇组ERα表达显著升高,并远远高出正常组。8.3 DNMT1蛋白表达:Hcy处理过后的HUVECs DNMT1表达水平显著降低,LWDHF含药血清干预后的细胞DNMT1表达水平上升;熟地/泽泻、山药/茯苓药对含药血清均有上调DNMT1表达的作用。结论1、LWDHF含药血清对H₂O₂损伤后的HUVECs具有保护作用。2、LWDHF含药血清可以通过绑定雌激素受体,发挥类雌激素样作用,促进内皮细胞增殖,抑制凋亡,改善NOS和NO生成,从而起到保护作用,并且其作用依赖于ERα的表达。3、LWDHF可能是通过调节血清Hcy水平,影响DNMTs表达,上调ERα水平,从而发挥抗内皮细胞损伤,抑制更年期AS形成的作用。