论文部分内容阅读
目的：(1)探索大鼠结肠成纤维细胞(CFB)的培养方法，拟证明CFB是导致UC纤维化的关键细胞之一。(2)观察IGF-Ⅰ和TGF-β1对大鼠CFB增殖的影响。(3)探索艾灸对UC纤维化大鼠CFB的调节机制。
方法：(1)采用消化法分离培养大鼠CFB。MTT法观察不同浓度IGF-Ⅰ、TGF-β1对大鼠CFB增殖的影响，及二者的相互作用关系。(2)采用免疫法加局部刺激制备UC纤维化大鼠模型，随机将大鼠分为正常组、模型组、隔药灸组、温和灸组和SASP灌胃组。隔药灸组、温和灸组选取天枢、气海穴分别进行隔药灸、温和灸治疗。(3)消化法分离培养各组大鼠CFB并提取上清液；MTT比色法观察各组大鼠CFB的生长曲线；流式细胞术检测其增殖率；western印迹法分析CFB合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白的含量；酶联免疫吸附测定(ELISA)各组大鼠上清液诱导正常大鼠分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的含量，以及各组大鼠CFB分泌IGF-Ⅰ、TGF-β1的含量，观察隔药灸、温和灸和SASP灌胃对大鼠CFB增殖、胶原合成、IGF-Ⅰ、TGF-β1分泌的影响。
结果：(1)原代培养的大鼠结肠成纤维细胞的最佳生长条件为，含10％进口胎牛血清的DMEM/F-12。(2)正常大鼠CFB为V+/D-/A-型细胞，UC纤维化大鼠CFB为V+/D-/A+型细胞。(3)IGF-Ⅰ能促进正常大鼠CFB增殖，随着IGF-Ⅰ浓度的增加，细胞倍增时间缩短，在10-100ng/ml浓度范围内呈剂量效应趋势，各组倍增时间的差异无统计学意义(p＞0.05)。(4)TGF-β1在低浓度(0.1ng/ml)时可促进正常大鼠CFB的增殖，随着浓度的增加，促增殖作用明显减弱，各组倍增时间的差异无统计学意义(p＞0.05)。(5)TGF-β1、IGF-Ⅰ联合应用效果叠加。随着IGF-Ⅰ浓度的增加，细胞倍增时间缩短，呈剂量依赖趋势，各组倍增时间的差异无统计学意义(p＞0.05)。(6)UC纤维化大鼠CFB倍增时间缩短，增殖率增高(p＜0.01)；CFB细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原合成增加(p＜0.01)；CFB上清液中IGF-Ⅰ、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量增多(p＜0.01)。隔药灸、温和灸疗法能延长大鼠CFB的增殖时间，抑制其增殖率(p＜0.05，p＜0.01)；抑制其细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原合成(p＜0.05，p＜0.01)，IGF-Ⅰ、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的分泌(p＜0.05，p＜0.01)。
结论：(1)成功分离培养大鼠CFB。(2)CFB是导致UC纤维化发生发展的关键细增高，促增殖效应减弱；若选用得当，二者协同促进CFB增殖。(4)IGF-Ⅰ、TGFβ1是促胶原分泌物质之一。(5)UC纤维化发生发展的关键病理机制之一是：反复发作的炎症导致CFB的活化与过度增殖，IGF-Ⅰ、TGF-β1分泌增多，ECM的重要组份Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原过量沉积。(6)艾灸大鼠天枢、气海穴调控UC大鼠纤维化的可能机制为：通过延长大鼠CFB的增殖时间，抑制其增殖率，抑制CFB分泌IGF-Ⅰ、TGF-β1，抑制CFB合成分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，抑制ECM的过度沉积。