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目的1.建立高糖高脂饲喂联合多次给予链脲佐菌素(STZ)诱导的树鼩糖尿病肾病模型及评价技术方法。2.观察体外DAPI标记的树鼩骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗树鼩糖尿病肾病的技术方法和疗效,为干细胞治疗糖尿病肾病提供理论依据及参考方法。方法1.树鼩糖尿病肾病模型的建立：采用饲喂高糖高脂饲料的同时给予4次空腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ100mg/kg)的方法建立树鼩糖尿病肾病模型。用自动生化分析仪检测树鼩外周血葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、肌酐、尿素、胰岛素、糖化血红蛋白含量,常规观察24h尿蛋白含量、24h尿量、体重以及口服葡萄糖耐量实验(OGTT)分析模型动物的糖耐量。进一步采用组织学结构分析法进行常规HE染色,观察胰腺、肾脏的病理学特征,确认模型符合糖尿病肾病的基本标准。将具有典型糖尿病肾病特点的树鼩模型纳入进一步实验研究。2.树鼩骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及标记：无菌条件下取树鼩股骨和胫骨骨髓细胞,参照本实验室前期建立的人和其它动物来源的骨髓间充质干细胞体外培养技术方法进行原代贴壁培养和体外传代扩增。采用流式细胞分析仪检测树鼩骨髓间充质干细胞表面抗原CD90.CD105.CD31.CD34表达情况,观察骨髓间充质干细胞特异性抗原阳性表达率。为追踪移植细胞在模型动物体内的分布和演变情况,本实验采用体外共培养法进行DAPI体外标记树鼩BMSCs,通过荧光显微镜分析标记率。3.树鼩BMSCs移植及移植后疗效分析：STZ注射后第12w开始对DN+MSC组树鼩分两次(第0天,第14天)经尾静脉注射DAPI标记的BMSCs (5×106kg),其余对照组和DN组树鼩均注射等体积的生理盐水。采用自动生化分析仪检测BMSCs移植后树鼩外周血中血糖、甘油三脂、总胆固醇、肌酐、尿素、胰岛素、24h尿量、24h尿蛋白的含量变化。取胰腺、肾脏组织,4%多聚甲醛固定,按常规方法进行组织切片,HE染色,在光镜下观察其病理组织结构变化并拍照。取胰腺、肾脏组织进行冰冻切片并采用荧光显微镜观察移植细胞在组织中的分布情况。4.统计学方法：所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析,计量资料以均数士标准差(x±s)表示,组间差异的统计学比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。 P<0.05表示差异具有统计学意义。结果：1.树鼩糖尿病肾病模型指标：模型组树鼩出现多饮、多尿等临床症状；整个实验过程中血糖显著升高(23.59±1.37vs.3.56±0.76,P<0.01),甘油三脂(1.25±0.2vs.0.59±0.11,P<0.01),总胆固醇(7.46±0.79vs.2.84±0.24,P<0.01),肌酐(43.25±7.25vs.19.25±3.3,P<0.01),尿素(15.75±2.83vs.6.00±0.26,P<0.01),24h尿蛋白含量(4.74±1.62vs.1.38±0.86,P<0.01)明显升高；24h尿量明显增多(18.56±3.47vs.3.50±1.29,P<0.01),并随着病程的延长明显增加；体重下降明显(126±8vs.160±12,P<0.01)；胰岛素水平在第1w时显著增加(8.51±1.25vs.4.95±1.33,P<0.01),但在第3w后胰岛素水平与对照组比较显著下降(2.99±0.86vs.3.75±1.34,P<0.01),且随病程延长胰岛素水平下降较明显。胰腺、肾脏的病理组织学变化：胰腺：对照组胰岛为圆形或椭圆形、形态完整、界限清楚；模型组胰岛数量明显减少、萎缩,体积变小,胰岛界限不清楚,细胞变性,水肿,细胞核萎缩；肾脏：对照组肾小球结构清晰,未见系膜基质增生及基底膜增厚,间质无炎症和纤维化；模型组可见肾小球体积增大,囊腔缩小,毛细血管上皮细胞排列紊乱,肿胀；毛细血管管腔变窄,部分闭塞,系膜基质增宽,基底膜增厚,与其它动物的糖尿病肾病变化较一致。2.树鼩骨髓间充质干细胞培养、鉴定及体外标记：第3代骨髓间充质干细胞呈梭形、漩涡状生长。流式细胞仪表面标志鉴定CD90(95.3%)、CD105(99.4%)呈阳性,CD31(0.0%)、CD34(0.0%)呈阴性；符合骨髓间充质干细胞的生长特性,并成功用DAPI对其进行了标记,标记率≥98%。3. DAPI标记的BMSCs移植治疗21d后树鼩血糖、血脂、肾功能变化：DN+MSC组树鼩多饮、多尿、消瘦等症状较DN组减轻,但体重无显著变化(128±8vs.122±11,P>0.05)；血糖于治疗21d后显著下降(13.98±4.16vs.21.89±3.87,P<0.01)；治疗21d后DN+MSC组甘油三酯(0.99±0.15vs.1.34±0.29,P<0.01),总胆固醇(4.32±0.21vs.6.38±0.49,P<0.01),24h尿量(12.74±1.82vs.20.67±1.43,P<0.01)水平较DN组显著下降,但仍高于对照组(P<0.01)；尿素(12.65±1.30vs.16.16±2.55,P<0.05),24h尿蛋白(4.09±0.51vs.5.08±0.29,P<0.05),胰岛素(0.78±0.24vs.0.26±0.14,P<0.05),肌酐(35.06±4.13vs.44.17±5.05,P<0.05)水平较DN组下降。移植入骨髓间充质干细胞21d后DN+MSC组树鼩胰腺的胰岛损伤较DN组未见明显差异；肾脏肾小球肥大,肾小球毛细血管缩窄、肾小球囊腔缩小较DN组减轻。4. DAPI标记的BMSCs移植入DN+MSC组树鼩体内21d后,取DN组和DN+MSC组胰腺、肾脏做成冰冻切片,置于荧光显微镜下观察,可见胰岛周围及肾间质部有少量带蓝色荧光的细胞,说明干细胞移植后有部分能够到达肾脏并存活。结论：1.本实验采用高糖高脂饲料联合4次STZ (100mg/kg)空腹腹腔注射的方法,初步建立了树鼩糖尿病肾病模型和模型评价技术。2.采用细胞贴壁培养法分离培养获得树鼩骨髓间充质干细胞,在培养至第3代时,选取CD90、CD105、 CD31、 CD34作为树鼩骨髓间充质干细胞的抗原表达鉴定,CD90、CD105阳性率分别为95.3%、99.4%,与人或其他动物的BMSCs的分析结果一致。3.本实验采用DAPI成功标记树鼩骨髓间充质干细胞,标记率≥98%。4.本实验建立了DAPI标记细胞的技术。DAPI标记的BMSCs移植治疗21d后,DN+MSC组树鼩血糖、血脂、肾功能水平较DN组和治疗前显著下降,胰岛素水平较DN组及治疗前有所升高,表明BMSCs能够显著降低DN树鼩的血糖、血脂含量,改善肾功能。5. DAPI标记的BMSCs移植治疗21d后,取胰腺组织作冰冻切片,荧光显微镜下观察有少量DAPI标记的细胞分布于DN+MSC组树鼩胰腺的胰岛周围,但胰岛病理结构与DN组比较并无显著差异,说明BMSCs对树鼩糖尿病的治疗作用还存在非胰岛损伤修复机制。6. DAPI标记的BMSCs移植治疗21d后,取肾脏组织作冰冻切片,荧光显微镜下观察有DAPI标记的细胞分布在肾间质部；病理组织切片观察发现肾小球肥大、肾小球毛细血管缩窄、肾小球囊腔缩小较DN组减轻,提示BMSCs可能参与了树鼩糖尿病肾病的肾脏损伤修复,从而改变结构和功能。