长链非编码RNA促进阵发性睡眠性血红蛋白尿症克隆增殖的作用研究

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jimmy7872
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目的:通过基因测序技术分析PNH患者CD59-和CD59+粒单细胞长链非编码RNA(LncRNA)和mRNA,筛选并研究其在PNH克隆增殖中的作用,初步探讨LncRNA促进PNH克隆获得增殖优势的作用及可能机制;探讨重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者接受抗人胸腺细胞免疫球蛋白(Anti-human Thymocyte Globulin,ATG)治疗前后PNH克隆演变与免疫状态的关系及其对疗效的影响。内容与方法:1.选取PNH患者5例,流式细胞术分选外周血CD59-和CD59+粒单细胞,分别进行LncRNA及mRNA基因测序,对测序原始数据进行生物信息处理、分析并筛选差异表达基因。分析其表达量、表达率及功能;对筛选出的mRNA进行功能聚类分析,同时进行KEGG信号通路富集分析,通过共表达法筛选上游LncRNA,然后在30例PNH患者中通过q RT-PCR技术进行验证,并与PNH患者血细胞数、溶血指标【网织红细胞(Ret)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、游离血红蛋白、结合珠蛋白】、PNH克隆比例进行相关性分析。2.构建Cas9过表达慢病毒和sg RNA过表达慢病毒,感染THP-1细胞,再通过流式分选对GFP(Cas9载体)和m Cherry(sg RNA载体)阳性的细胞进行筛选,挑选单克隆经鉴定后进行扩增,最终得到PIGA基因片段敲除的单克隆细胞株。流式细胞术(检测FLAER及CD59)和Snapgene基因测序验证。应用慢病毒转染技术敲低FAM157C基因,流式细胞术检测转染率,PCR检测敲低率,并检测细胞增殖凋亡指标。3.回顾性分析天津医科大学总医院血液科102例接受ATG联合环孢素(Cyclosporin A,Cs A)治疗的SAA患者的临床资料,总结伴和不伴PNH克隆患者的临床特征,比较各组患者缓解率(CR+PR%)和缓解时间,及在不同的时间点(0月,3月,6月,12月,24月,36月)的应答率、造血和免疫指标(CD3+CD4+/CD3+、CD3+CD8+/CD3+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、Th1/Th2、m DC/p DC、CD8+HLADR+/CD8+),并随访恶性克隆出现情况。结果:1.PNH克隆细胞差异LncRNAs及mRNAs筛选:(1)对5例PNH患者进行LncRNA及mRNA基因检测,转录谱分析在CD59-粒单细胞和CD59+粒单细胞比较中发现了742个上调和1376个下调LncRNAs,3276个上调和213个下调mRNAs。(2)基因表达量FPKM>5和3例及以上患者表达共有173个上调mRNAs。筛选出30个与增殖、凋亡、血栓形成等相关的mRNAs(CXCR2,CXCL8,MCL1,CXCL1,LYN,PTGS2等)。筛选出FPKM>5和3例及以上患者表达的7个上调LncRNAs(MALAT1,RP13-20L14.10,RP11-22N19.2,LUCAT1,FAM157C,CTD-2530H12.2,RP4-669L17.10)。(3)通过KEGG通路富集分析,富集了细胞增殖、自噬、内吞、血小板激活等通路,与增殖相关的有TNF、NF-κB等通路。我们重点关注增殖相关通路NF-κB通路。选取FPKM>10和3例及以上患者表达的mRNAs,寻找其上游调控LncRNAs。共筛选出8个mRNAs(TAB2,TLR4,LYN,CFLAR,TNFAIP3,PTGS2,TRIM25,CXCL8),上游调控LncRNAs 6个(MALAT1,LINC01002,FAM157C,CTD-2530H12.2,XLOC-064331,XLOC-106677)。只有MALAT1、LINC01002和FAM157C被设计出合适的引物序列。(4)通过q RT-PCR技术检测30例PNH患者NF-κB通路中筛选出来的LncRNAs和mRNAs的表达。q RT-PCR结果显示:30例PNH患者CD59-粒单细胞MALA(3.070±2.503)和FAM157C(11.530±6.628)的表达均明显高于CD59+粒单细胞中的表达(1.281±1.246,5.482±6.785)(p=0.0004,p=0.0055)。CD59-粒单细胞与CD59+粒单细胞比较LncRNA LINC01002的表达无明显统计学意义(6.139±11.15,5.602±10.180,p=0.8690)。两组比较mRNA的表达均无明显统计学意义。(5)LncRNA MALAT1和FAM157C与PNH患者临床指标进行相关性分析:MALAT1和FAM157C的表达量与LDH水平(r=0.6244,p=0.0307;r=0.4120,p=0.0407)和CD59-粒单细胞比例(r=0.5188,p=0.0049;r=0.4393,p=0.0280)呈正相关。(6)LncRNA MALAT1共表达mRNA CXCR2,CD59-粒单细胞mRNA CXCR2的表达明显高于CD59+粒单细胞的表达(3.230±2.336,1.049±1.307,p=0.0008)。CXCR2的表达量与LDH水平(r=0.4941,p=0.0166)和CD59-粒单细胞比例(r=0.4447,p=0.0335)呈正相关。2.敲除FAM157C基因对PNH克隆增殖的影响:(1)构建PIGA基因敲除THP-1细胞株,慢病毒转染技术敲低该细胞株FAM157C的表达,流式细胞术检测转染率为70%,q RT-PCR技术检测敲低率为90%。(2)细胞增殖实验结果显示:慢病毒转染后24h,对照组、空病毒组和FAM157C敲低组细胞的细胞活力(%)分别为:(100±0)、(95.20±3.178)和(91.93±5.423),三组比较无明显差异(p=0.1807)。转染后48h,对照组、空病毒组和FAM157C敲低组细胞的细胞活力分别为:(100±0)、(93.75±5.995)和(77.49±6.597)),FAM157C敲低组细胞活力明显低于空病毒组和对照组(p值分别为0.0388和0.0275),对照组与空病毒组比较无明显差异(p=0.163)。转染后72h,对照组、空病毒转染组和FAM157C敲低组细胞的细胞活力(%)分别为:100±0、92.79±5.802和60.47±2.059,FAM157C敲低组较空病毒组、对照组细胞活力显著下降(p值分别为0.0052和0.0009),空病毒转染组与对照组间无明显差异(p=0.1420)。(3)细胞凋亡实验结果显示:慢病毒FAM157C转染后24h,对照组、空病毒组和FAM157C敲低组细胞的凋亡率分别为:(2.483±0.3083)%、(2.926±0.5517)%和(6.256±0.5453)%。FAM157C敲低组凋亡率明显高于空病毒组和对照组(p值分别为0.0066和0.0138),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.0899)。转染后48h,对照组、空病毒组和FAM157C敲低组细胞的凋亡率分别为:(5.593±0.6400)%、(6.723±0.3256)%和(11.30±1.075)%。FAM157C敲低组凋亡率明显高于空病毒组和对照组(p值分别为0.0217和0.0137),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.0757)。转染后72h,对照组、空病毒转染组和FAM157C敲低组细胞的凋亡率分别为:(9.797±0.3235)%、(10.21±0.3005)%和(18.81±0.5363)%。FAM157C敲低组较空病毒组、对照组凋亡率显著增高(p值分别为0.0007和0.0012),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.0633)。(4)细胞周期实验结果显示:慢病毒FAM157C转染后,对照组、空病毒组及FAM157C敲低组细胞G0/G1期分别为(62.98±1.513)%、(65.95±1.174)%和(70.00±0.2404)%;S期分别为(3.825±0.7849)%、(5.920±0.9192)%和(13.47±1.039)%;G2期分别为(32.81±1.612)%、(27.47±1.160)%和(16.54±0.7990)%,三组间比较均有统计学差异(p=0.0269,0.0198,0.0145)。组间比较:FAM157C敲低组G0/G1期与空病毒组及对照组比较有显著性差异(p值分别为0.0220和<0.0001),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.0596)。FAM157C敲低组S期与空病毒组及对照组比较有显著性差异(p值分别为0.0023和0.0059),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.1417)。FAM157C敲低组G2期与空病毒组及对照组比较有显著性差异(p值分别为0.0053和0.0018),对照组与空病毒组间无明显差异(p=0.0697)。FAM157C敲低后,处于G0/G1期和S期细胞比例增加,G2期细胞比例减低,细胞阻滞于G0/G1和S期。3.102例SAA患者的临床资料总结:(1)共有32例患者(31%)伴PNH克隆,中位PNH克隆百分比为10.57%(5.22%-42.38%),其中22例为治疗前伴PNH克隆,10例为ATG治疗后出现PNH克隆。治疗前22例伴PNH克隆患者,阳性率为22%,治疗前中位PNH克隆百分比为10.35%(6.6%-28.60%),治疗后18例仍伴有PNH克隆,4例转为阴性。10例治疗后出现PNH克隆患者,PNH克隆的中位百分比为13.55%(5.22%-42.38%),PNH克隆出现的中位时间为ATG应用后15个月。分成治疗前伴PNH克隆组,治疗后出现PNH克隆组及不伴PNH克隆组三组,治疗前三组白细胞(WBC,×109/L)、中性粒细胞(N%)、血红蛋白(Hb,g/L)、血小板(PLT,×109/L)、Ret%、LDH(U/L)及免疫指标均无明显统计学意义(p均>0.05)。(2)临床疗效比较:治疗前伴PNH克隆组,治疗后出现PNH克隆组及不伴PNH克隆组三组缓解率比较具有统计学意义(68%,90%,56%,p=0.0175),治疗后出现PNH克隆组缓解率明显高于不伴PNH克隆组(p=0.0031),三组缓解时间比较无统计学意义(p=0.1728)。观察不同时间点的应答率发现,仅在治疗后12个月时三组的应答率比较具有统计学意义(p=0.0349),治疗前伴PNH克隆组和治疗后出现PNH克隆组的应答率(68%,70%)明显高于不伴PNH克隆组(40%)(p=0.0287,0.0458)。(3)造血功能恢复情况:治疗后6个月,三组中性粒细胞比例(N%)比较具有统计学意义(p=0.0067),治疗后出现PNH克隆组与不伴PNH克隆组的N%均高于治疗前伴PNH克隆组。治疗后12个月,三组Hb比较具有统计学意义(p=0.0484),治疗前伴PNH克隆组的Hb明显高于不伴PNH克隆组。三组Ret%比较具有统计学意义(p=0.0044),治疗后出现PNH克隆组明显高于其余两组。(4)免疫状态恢复情况:治疗后6个月,三组CD8+HLA-DR+/CD8+比例比较具有统计学意义(22.26±4.993,17.04±6.447,27.41±5.446,p=0.0027),治疗后出现PNH克隆组CD8+HLA-DR+/CD8+比例明显低于不伴PNH克隆组(p?0.01)。治疗后12个月,三组Th1/Th2比值比较具有统计学意义(2.070±1.361,1.758±1.598,3.210±1.566,p=0.0266),治疗前伴PNH克隆组和治疗后出现PNH克隆组Th1/Th2比值明显低于不伴PNH克隆组(p?0.05)。三组CD8+HLA-DR+/CD8+比例具有统计学意义(22.88±17.50,13.72±4.928,29.93±7.335,p=0.0377),治疗后出现PNH克隆组CD8+HLA-DR+/CD8+比例明显低于不伴PNH克隆组(p?0.05)。(5)出现恶性克隆情况:随访期间,6例转为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS),均发现-7染色体异常。其中治疗前伴PNH克隆组2例,治疗后出现PNH克隆组2例,不伴PNH克隆组2例。结论:1、应用基因测序技术检测PNH患者CD59-和CD59+粒单细胞LncRNA及mRNA的表达,筛选出差异表达LncRNA MALAT1,LINC01002,FAM157C,CTD-2530H12.2,XLOC-064331,XLOC-106677等,它们与增殖、凋亡、血栓形成等相关,表明LncRNAs可能在PNH中发挥重要作用。2、通过KEGG通路分析,对增殖通路NF-κB通路中的mRNAs及LncRNAs通过q RT-PCR技术进行验证,发现LncRNA MALAT1和FAM157C在PNH克隆细胞中表达明显升高,并与CD59-粒单细胞比例及LDH水平正相关,表明MALAT1和FAM157C可能在PNH克隆增殖中发挥重要作用。3、LncRNA MALAT1共表达mRNA CXCR2在PNH克隆细胞中表达明显升高,并与CD59-粒单细胞比例及LDH水平正相关,表明MALAT1可能通过调控CXCR2在PNH克隆增殖中发挥作用。4、LncRNA FAM157C基因敲低后,细胞阻滞于G0/G1和S期,细胞的凋亡率增加,增殖能力减弱,表明FAM157C参与了PNH克隆的异常增殖。5、伴PNH克隆的SAA患者的细胞毒性T细胞功能和Th1细胞数量恢复得更快,对IST有更好的治疗反应;随访期间,伴或不伴PNH克隆的SAA患者均有少数患者出现MDS恶性克隆。
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