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实验目的:Ecliptasaponin A(ES),旱莲苷A是一种天然产物,在多种肿瘤中已被报道具有抗癌效果,但在肺癌中的作用效应仍未知,本文对旱莲苷A在体内外的抗非小细胞肺癌的效果进行系统评价,并探索其抗肿瘤的分子机制。方法与结果:第一部分旱莲苷A在体内外抗肺癌作用评价采用MTT比色法、集落克隆试验测定旱莲苷A对非小细胞肺癌H460和H1975细胞增殖能力的影响,并通过流式细胞术检测细胞周期的变化及凋亡发生情况。Hoechst 33342染色用于明确旱莲苷A作用后肺癌细胞发生凋亡形态变化。免疫荧光检测旱莲苷A对肺癌细胞自噬发生的影响。采用划痕实验、Transwell迁移、Transwell侵袭试验验证旱莲苷A对肺癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用免疫印迹实验(Western Blot)在非小细胞肺癌细胞中,对上述周期、凋亡、自噬、迁移和侵袭相关蛋白的表达水平进行测定,进一步验证旱莲苷A在体内抗肺癌作用方面的效果。应用移植瘤模型,设立对照组、ES低剂量组和高剂量组,验证旱莲苷A在体内的抗肿瘤效果。结果显示,非小细胞肺癌细胞的存活率随着旱莲苷A药物浓度的增加而逐渐降低,并呈时间依赖。同时,旱莲苷A使非小细胞肺癌细胞出现G0/G1期阻滞。旱莲苷A能诱导肺癌细胞H460和H1975发生凋亡和自噬,且呈剂量依赖。同时亦证实旱莲苷A对肺癌细胞的迁移和侵袭有抑制作用。周期相关蛋白Cyclin D1,CDK6,P21,凋亡相关蛋白cleaved caspase 8,cleaved caspase 9,cleaved caspase 3及Bax和Bcl-2,自噬相关蛋白LC3a/b、beclin-1及p62,迁移和侵袭相关蛋白E-cadherin,N-cadherin和Vimentin等蛋白亦发生相应改变。在选用的人肺癌H460裸小鼠皮下移植瘤模型中,发现50mg/Kg旱莲苷A,每三天给1次药,能显著抑制移植瘤的生长,且小鼠并未出现明显的体重降低。第二部分旱莲苷A的抗肿瘤作用机制研究第一节旱莲苷A诱导肺癌细胞凋亡和自噬的相互作用及其相关机制通过流式细胞检测术发现,旱莲苷A诱导肺癌细胞发生凋亡,且这种凋亡能被Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)逆转。通过流式细胞检测术和免疫印迹实验发现,自噬抑制剂3-MA和CQ能阻断自噬发生,进而减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。进一步探讨发现旱莲苷A通过激活ASK1/JNK通路促进非小细胞肺癌细胞的凋亡,ASK1抑制剂GS-4997和JNK抑制剂SP600125能逆转旱莲苷A引起的凋亡,且SP600125也能抑制旱莲苷A引起的自噬。第二节内质网应激在旱莲苷A抗肿瘤效应中的分子机制研究通过免疫印迹实验发现旱莲苷A作用于H460和H1975细胞后引起内质网应激,Bip、IRE1α、XBP1s及c-Myc等蛋白水平表达增高。流式细胞检测术显示内质网抑制剂4-PBA能减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。一方面,通过流式细胞检测术发现IRE1α的激酶抑制剂kira6能逆转旱莲苷A引起的凋亡,免疫印迹实验发现kira6能降低旱莲苷A作用后增高的磷酸化的IRE1α、ASK1和JNK的表达水平,阐明了内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路在旱莲苷A促进肺癌细胞凋亡中的作用。另一方面,通过流式细胞检测术发现IRE1α的核酸内切酶抑制剂STF-083010促进旱莲苷A引起的凋亡,c-Myc抑制剂10058-F4亦能促进旱莲苷A引起的凋亡;免疫印迹实验发现STF-083010能降低XBP1s和c-Myc蛋白的表达水平,使cleaved caspase3的表达水平增高,阐明了IRE1α/XBP1/c-Myc通路在旱莲苷A促进肺癌细胞生存中的作用。第三节旱莲苷A通过抑制PKCα/STAT3的表达,从而促进肺癌细胞凋亡免疫印迹实验发现旱莲苷A能抑制非小细胞肺癌细胞H460和H1975内PKCα和STAT3的表达。通过流式细胞术和免疫印迹实验,使用PKCα的抑制剂Sotrastaurin能促进莲苷A引起的肺癌细胞凋亡;通过质粒转染持续表达PKCα可减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡,此外,抑制PKCα能降低STAT3的表达。使用IL-6促进STAT3的表达可减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡;使用S3I-201抑制STAT3的作用可促进旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。结论:一、本文通过探讨旱莲苷A在体内外的抗肺癌效应,发现旱莲苷A具有显著的体外抗肺癌作用,能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期,能促进肺癌细胞发生凋亡和自噬,能抑制肺癌细胞的迁移和侵袭,裸鼠皮下移植瘤模型中提示其在体内显著抑制移植瘤的生长。二、研究旱莲苷A诱导凋亡发生的分子机制,发现:1.旱莲苷A诱导肺癌细胞的凋亡和自噬,且自噬又能促进肺癌细胞的凋亡。旱莲苷A通过调节ASK1/JNK通路促进肺癌细胞的凋亡;JNK通路又能促进肺癌细胞的自噬。2.内质网应激在旱莲苷A抗肿瘤效应中发挥着“双刃剑”的作用。旱莲苷A通过增强IRE1α的激酶活性,激活IRE1α/ASK1/JNK通路,促进肺癌细胞的凋亡;旱莲苷A通过增强IRE1α的核酸内切酶作用,激活IRE1α/XBP1/c-Myc通路,促进肺癌细胞的生存。3.进一步研究还发现,旱莲苷A能通过抑制PKCα/STAT3通路,促进肺癌细胞的凋亡。