目的:　　 1、研究rVvhA对THP-1细胞的生长抑制作用。　　 2、研究rVvhA对THP-1细胞内Ca2+浓度的影响。　　 3、研究rVvhA致THP-1细胞的凋亡途径。　　 方法:　　 1、IPTG诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌，表达获取重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVvhA)，SDS-PAGE分析表达产物。三步洗涤、变性、Ni2+-NTA亲和层析法纯化表达产物。复性结合分步透析法复性目的蛋白。活性目的蛋白经冷冻干燥、PBS溶解、浓度测定分装储存于-80℃。　　 2、CCK-8法分析不同浓度rVvhA活性蛋白对THP-1细胞生长抑制作用。同时，光学显微镜记录细胞的形态变化。　　 3、可见分光光度法测定rVvhA作用THP-1细胞培养上清中钾离子。　　 4、比色法测定rVvhA作用THP-1细胞培养上清中乳酸脱氢酶。　　 5、激光共聚焦显微镜测定rVvhA作用THP-1细胞内钙离子浓度的瞬间变化。CCK-8法分析钙离子对THP-1存活率的影响。　　 6、酶标仪测定rVvhA作用THP-1细胞内caspase-3和caspase-9的活性。　　 7、AnnexinV-FITC/PI标记法检测rVvhA作用THP-1细胞的凋亡及坏死率。　　 结果:　　 1、重组蛋白分子量大小约为54kDa。经三步洗涤及Ni2+-NTA层析纯化后，其纯度可达90.0％左右。纯化目的蛋白经复性透析后具有溶血活性。　　 2、rVvhA活性蛋白对THP-1细胞有细胞毒性作用，且呈剂量依赖性。6、8、10、12、14、16、18μg/ml rVvhA作用5h后，THP-1存活率分别为88.5％、79.5％、71.5％、68.75％、55.12％、45.23％、38.25％。普通显微镜观察到，随着蛋白作用浓度的提高，细胞开始发生皱缩，变形，而18μg/ml rVvhA作用5h后细胞出现裂解死亡。　　 3、12μg/ml rVvhA分别作用1h，3h，6h后，THP-1细胞培养上清K+释放增加;LDH测定结果显示，12μg/ml rVvhA作用6h或10h后，THP-1细胞LDH释放显著升高，与对照组相比升高约2～3倍。　　 4、12μg/ml rVvhA作用后THP-1细胞内瞬时钙离子浓度与起始值相比升高约1.8倍。1000μmol/L EGTA预处理后，胞内钙离子浓度与对照组相比下降约1.2倍。　　 5、12μg/ml rVvhA作用5h、6h、9h后，THP-1细胞内caspase-9和caspase-3分别为(1.28，1.5)％，(1.42，1.83)％，(1.86，2.34)％，与对照组相比活性均增强;12μg/ml rVvhA活性蛋白作用5h后，THP-1凋亡率约为20％。　　 结论:　　 rVvhA对THP-1细胞有细胞毒性作用;可使THP-1细胞LDH、K+的释放增加，较大剂量时能直接引起细胞裂解坏死;能引起THP-1细胞外钙离子瞬间内流，内流的钙离子对THP-1细胞的存活率无影响，EGTA预处理可以大幅降低rVvhA引起的胞内钙离子浓度;可通过caspase-9/3途径致THP-1细胞凋亡。