出芽短梗霉(Aureobiasidium pullulans)是一种多形态真菌,在其酵母状细胞内可分泌一种胞外多糖——出芽短梗孢糖(pullulan),又称普鲁兰糖,其分子由麦芽三糖α-1,6-糖苷键连接而成。该糖无色、无味,对人体无任何毒副作用,具有优良的水溶性、成膜性等独特的化学和生物学特性,广泛应用于医药、食品、化妆品.烟草和农业等领域,是具有较大经济价值和开发潜力的多功能生物产品。鉴于普鲁兰糖在生产中广泛的应用前景,广大研究人员希望通过物理、化学等诱变技术获得普鲁兰糖产量高的菌株。但由于菌株遗传的不稳定性,较难得到理想的菌株。分子生物学、基因工程等学科的飞速发展,为产生普鲁兰糖相关的基因进行研究提供研究条件。本研究试图通过表达谱的分析和不同蛋白质序列的测定,找到和普鲁兰糖代谢相关的基因,为获得普鲁兰糖高产工程菌株打下基础。本实验从蛋白差异性入手,将培养1-3天的出芽短梗霉菌液收集离心。菌体破菌后进行SDS-PAGE的长胶电泳,发现培养1,2和3天的菌体蛋白表达量有差异。将20条差异蛋白的条带切下后,进行质谱分析,获得了18种参考蛋白,其中3-磷酸甘油醛脱氢酶多次出现,推测此酶可能与普鲁兰糖代谢相关。取3-磷酸甘油醛脱氢酶基因设计简并引物,以基因组DNA为模板,扩增出大约280bp的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段。通过Genbank进行Blast比对后发现,其核酸序列与毛壳菌、霉菌等亲缘菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因有极高的相似度。利用短侧翼同源区PCR的方法设计一段含3-磷酸甘油醛脱氢酶基因侧翼和Zeocin抗生素基因的同源序列,以pPICZa质粒为模板进行扩增,扩增出含3-磷酸甘油醛脱氢酶基因侧翼的Zeocin抗生素片段。将片段电击转化入出芽短梗霉细胞,利用报告基因Zeocin筛选到5株重组克隆子。通过PCR验证,获得了2个敲除3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的工程菌。通过显微镜观察,发现重组克隆菌形态比出发菌体积小,产糖量也少。结果说明3-磷酸甘油醛脱氢酶基因在出芽短梗霉的普鲁兰糖代谢中发挥重要作用。