论文部分内容阅读
目的：探索Rafl的表达水平与非小细胞肺癌(NSCLC)临床因素及预后的关系,体外水平明确miRNA-643靶向调控Raf1对NSCLC细胞侵袭、转移及放射敏感性的影响。方法：免疫组化检测NSCLC患者石蜡标本组织中Raf1的表达,分析Rafl表达与患者临床病理特征、放疗疗效的相关性,风险比例模型(Cox回归)分析影响NSCLC预后的危险因素；采用western blot和RT-PCR方法检测不同NSCLC细胞株中Raf1的表达情况,选择不同表达Rafl的A549和H1299细胞株,通过瞬时转染获得Raf1基因表达上调的A549和表达下调的H1299细胞株,运用CCK8、克隆实验、划痕实验和Transwell小室检测Raf1基因对NSCLC细胞增殖、侵袭、转移及放射敏感性等生物学行为的影响。利用生物信息学在线软件预测调控Raf1的上游miRNA, RT-PCR检测miRNA-643在NSCLC细胞中的表达,双荧光素酶报告系统验证miRNA-643与Raf1的靶向调控关系；拯救实验验证miRNA-643调控靶基因Raf1表达在A549和H1299细胞侵袭、迁移能力和放射敏感性中的作用；同时检测AKT/NF-κB通路及凋亡蛋白的表达变化。结果：1、110例接受根治性放射治疗的NSCLC患者,Rafl蛋白表达49例(44.5%),其中高表达21例(19.1%)、低表达28例(25.5%),Raf1表达水平与肿瘤T分期、淋巴结转移和细胞分化程度呈显著相关(P<0.05)；Raf1表达组患者的疾病进展时间和3年总生存期明显差于Raf1不表达组(P<0.05)。2、Raf1在H1299细胞中呈相对高表达, 而在A549及H827细胞中表达相对较低。沉默Raf1基因后,H1299细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱,放射敏感性增加；而过表达Raf1基因后, A549细胞增殖、迁移及侵袭能力增加,放射抗拒增加。3、miRanda,TargetScan和TarBase在线预测miRNA-643可能与Raf1存在靶向关系,荧光素酶报告基因实验证实miRNA-643靶向结合Raf1的3’-UTR区。过表达miRNA-643后,在mRNA和蛋白水平抑制Raf1的表达。4、进一步实验显示,利用Raf1表达载体转染使稳定表达miRNA-643的H1299细胞株中Raf1基因拯救性过表达,过表达Raf1可回复由于稳定表达miRNA-643对细胞增殖、侵袭转移及放射抗拒的抑制作用；而在稳定干扰miRNA-643的A549细胞株中,干扰Raf1基因可减少由于miRNA-643低表达后细胞增殖、侵袭转移及放射抗拒。5、Rafl过表达后,AKT及p65的表达及活性上调,EMT标记蛋白E-cadherin表达下调,而Vimentin蛋白上调；Raf1下调,AKT、p65、Vimentin及凋亡蛋白caspase-3和caspase-9下调,而E-cadherin及凋亡蛋白c-caspase-3和c-caspase-9表达上调。结论：Raf1与NSCLC放疗后早期疾病进展及不良预后相关,增加NSCLC恶性进展及辐射抗拒；miRNA-643下调Raf1表达,在肺癌细胞增殖、侵袭转移和放射敏感性方面发挥重要作用；高表达miRNA-643的肺癌细胞的生物学行为活性减弱,具有抑癌作用,增加肺癌细胞放射敏感性,为NSCLC的分子靶向治疗及放射治疗提供新的探索方向。