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手性环氧氯丙烷是一种重要的手性合成子和医药中间体,被广泛应用于阿伐他汀、阿替洛尔、肉毒碱和费洛蒙等药物的合成制备中。在生物柴油的生产制备中会产生大量的副产物甘油,导致甘油价格一路下跌,因此,以甘油为原料来制备高附加值的手性环氧氯丙烷具有巨大的经济效益和应用前景。本论文通过研究甘油的化学加卤、二氯丙醇的生物脱卤和外消旋环氧氯丙烷的酶法不对称拆分,实现了甘油生产手性环氧氯丙烷的联产工艺,为其工业化应用奠定了理论基础。首先,本文根据文献报道合成了卤醇脱卤酶HheC的基因序列并在大肠杆菌中表达。通过对表达条件的优化获得了高活力的重组卤醇脱卤酶HheC。优化后的表达条件为:IPTG浓度0.5 mM,诱导温度28 ℃,诱导时间7 h,卤醇脱卤酶的活力最高达216 U/L。接着对HheC的酶学性质进行了研究,结果表明,HheC的最适pH为8.0,该酶的最高活力出现在50 ℃附近。温度稳定性实验表明,HheC对温度较为敏感,30 ℃时半衰期为108 h,而50 ℃下半衰期仅为5.3 h。以甘油为原料,先后通过化学加卤和卤醇脱卤酶脱卤合成外消旋环氧氯丙烷。加卤反应在一个自行设计的反应釜中进行,通过在反应液和回流球中加过量的干燥剂来吸收反应生成的水,从而促进反应更彻底进行。通过对催化剂的筛选和反应条件的优化,确定了以10%(w/w)异丁酸为催化剂,最适反应温度为110℃,反应液中最适干燥剂用量为5%(w/w),最适反应时间为8-9h。在此最优反应条件下,二氯丙醇的收率达93%。然后以分离提取后的二氯丙醇为底物,以卤醇脱卤酶HheC为催化剂,研究了反应温度、有机溶剂类型和有机溶剂含量等对环氧氯丙烷收率的影响。结果表明,提高温度有利于提高底物的转化率和产物的产率,但是较高温度下产物环氧氯丙烷自发水解强烈,导致其难于积累。利用两相反应体系可以明显降低环氧氯丙烷的水解,当以含40%(v/v)环己烷的pH 8.0磷酸盐缓冲液为反应体系时,环氧氯丙烷的最大收率达75.6%。以A niger ZJB-09103为出发菌株,通过60Co γ和UV的交替诱变后获得一株环氧化物水解酶高活性菌株A.nigerZJB-09173,比活力达33.7 U/g,与出发菌株相比,酶活提高了 167%。通过对突变株的形态观察发现,诱变菌株生长相对较慢,斜面呈白色或土灰色,菌丝体细小,孢子囊主要呈扫帚状。随后通过单因素法对诱变菌株产酶培养基成分和产酶条件进行了优化,确定最佳产酶培养基组分为(g/L):葡萄糖 18,豆饼粉 10,MgSO40.2,K2HPO40.8,KH2PO40.4;最适产酶条件为:初始pH 6.0,30 ℃。在此最优培养基成分和培养条件下培养4.5天,A.nigerZJB-09173生物量达9.5gCDW/L,环氧化物水解酶活力达330 U/L,相比于培养基和培养条件优化前,酶活提高了 74.6%。以A.nigerZJB-09173静息细胞为催化剂,对微水相体系中环氧氯丙烷的不对称水解进行了详细研究。结果表明,环己烷为最佳的微水相反应体系中的有机溶剂,最适反应温度30℃。高底物浓度(>90 mM)对酶的催化反应有显著的抑制作用,而产物3-氯-1,2-丙二醇却对反应没有明显的不利影响,较高浓度的产物对酶活还有一定的促进作用。为此,通过底物的补加,减少底物对催化的抑制作用,使得底物浓度为128 mM时(S)-环氧氯丙烷的ee值仍可达98%以上,最高收率可达16.4%。若以A.nigerZJB-09173干细胞为催化剂,在最佳含水量条件下,通过底物的连续补加可使底物浓度提高到153.6 mM,收率最大可达18.5%。通过合成文献报道的基因序列,构建了高效表达环氧化物水解酶的重组大肠杆菌,然后对此重组环氧化物水解酶在合成(R)-环氧氯丙烷中的应用进行了研究。在pH 8.0,30 ℃下拆分25.6 mM外消旋环氧氯丙烷,(R)-环氧氯丙烷的ee值≥99%,收率最大达42.7%。随后,对环氧氯丙烷两个构型之间的竞争性抑制以及产物抑制进行了研究。结果表明,(S)-环氧氯丙烷强烈抑制(R)-环氧氯丙烷的水解,抑制常数Ki=1.4 mM;而(R)-环氧氯丙烷对(S)-环氧氯丙烷水解的抑制程度则相对小得多,Ki为10.9mM。产物(S)-3-氯-1,2-丙二醇对酶催化(S)-环氧氯丙烷的水解产生非竞争性抑制,抑制常数Ki=203.6mM。通过底物的一次性投加,底物浓度最大可达320 mM;若通过底物连续流加的方式,底物浓度最大达448 mM;若采用两相反应体系,底物浓度可提高至512 mM。论文最后选用膨胀性珍珠岩为固定化载体,采用吸附培养法固定具环氧化物水解酶活力的重组E.coli细胞。当珍珠岩用量为4.5 g(50 ml培养基)时,细胞固定化率达65%,细胞固定化后酶活保留85%。固定化细胞与游离细胞相比,催化剂稳定性更高,产物耐受性更强,最适反应温度未发生明显改变而最适pH变大。采用同样的方法固定具有卤醇脱卤酶活力的重组E.coli细胞,在两个连接的鼓泡式生物反应器中,以固定化细胞作催化剂,采用卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶双酶两步法催化1,3-二氯丙醇合成(R)-环氧氯丙烷,ee值达99%以上,收率为25.1%。另外,研究发现,适当降低第一个反应器中空气的流速和增加第二个反应器中固定化细胞的用量可显著提高ee值和收率。