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弧菌属(Vibrio)为一类嗜盐杆菌,呈革兰氏阴性,广泛分布在河口、海水和海洋动物体内。致病性弧菌主要通过海产品、海水等感染人类,能够引起人体发生感染性腹泻、耳和伤口感染甚至败血症。随着生活质量的提高,人们对海产品的需求量越来越大,弧菌已然成为我国食源性疾病的重要病原菌之一。为能够快速有效地检测样品中的致病性弧菌。本研究将免疫磁分离技术(Immunomagnetic separation,IMS)分别与多重PCR和液相芯片(Luminex xMAP)检测方法结合,建立了能够同时富集五种常见致病性弧菌(副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌以及溶藻弧菌)的免疫磁分离技术与多重PCR和Luminex xMAP检测方法,该方法具有快速、简单、高通量和高灵敏性等优点,为开展弧菌的现场检测提供技术支撑。1、免疫磁珠的制备与目的菌的捕获效果为优化样品前处理这一步骤,本研究将实验室保存的针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及拟态弧菌共同抗原表位的单克隆抗体2-1-D4与磁珠偶联制备免疫磁珠从而建立了针对上述五种弧菌的免疫磁分离快速富集技术。在该技术中,采用碳化二亚胺(3-ethylcarbodiimide,EDC)/琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)化学偶联法制备免疫磁珠对免疫磁珠的制备进行了优化并按实际捕获效果来确定最佳条件;对富集过程中免疫磁珠的工作用量、捕获时间等进行了优化,并评价免疫磁珠的特异性、敏感性及其在食品基质模拟样品中的捕获效果。试验结果表明,1mL体系中免疫磁珠最佳工作量为0.33 mg,最佳捕获时间为60 min;免疫磁珠对副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌的捕获率均在50%以上,且其与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应,显示了该免疫磁珠良好的特异性。免疫磁珠作为样品前处理的步骤不仅能提高传统培养基检测的灵敏度和特异性,还能有效的减少人为操作的误差和提高检测的准确性。2、多重PCR快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立本试验通过筛选引物、优化建立了五种致病性弧菌的多重PCR检测体系。试验根据五种致病性弧菌的种特异性基因设计引物,选择副溶血弧菌toxR基因、霍乱弧菌ompW基因、创伤弧菌vvh基因、拟态弧菌vm-toxR基因和溶藻弧菌va-coL基因作为靶基因设计引物,以细菌16S rRNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC)设计了 IAC引物。通过对多重PCR反应体系中退火温度和引物浓度进行了优化,确定了最佳退火温度(57℃)和引物浓度(0.1 μmol/L)。通过对多重PCR的敏感性和特异性评价,确定了多重PCR同时检测五种弧菌模板时检测限度为1.8×105CFU/mL,且试验过程中该方法与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应。因此,建立的该检测方法具有特异性强,灵敏度高,操作简便,并且ICA的存在排除了多重PCR检测致病性弧菌可能导致的假阴性结果,提高了检测的精准度,在诊断与防范水产品食源性致病性弧菌传染方面具有重要意义。3、多重LuminexxMAP快速检测水产品中的五种致病性弧菌方法的建立本研究建立了同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌五种致病性弧菌的多重液相芯片检测技术,并对该方法进行了评价。分别设计带有生物素标记的针对这五种致病性弧菌种特异性基因和毒力基因的特异性引物,利用氨基标记的探针偶联羧基微球,通过该微球与生物素化的PCR产物杂交,Luminex 200分析系统能够分析编码微球的荧光分类和藻红蛋白的中强荧光值。通过对杂交时间和杂交温度进行优化确定了该反应最佳杂交条件为杂交温度52℃、杂交时间25 min。经过多次的实验结果证明,该方法均能对单一菌株样本和混合样本进行准确的检测鉴定。在重复试验中,其组内变异系数(CV%)为2.71%-7.68%,表明该方法具有较好的稳定性。同时对该方法的敏感性进行鉴定。结果表明多重Luminex xMAP在同时检测五种弧菌时,十组探针的敏感性在1.8×102 CFU/mL-1.8×104CFU/mL之间。以流式液相芯片技术为平台建立水产品中5种致病性弧菌的快速高通量检测体系,具有灵敏性高、重复性好、可控性强、节省样本和时间等优点,对于病原体的检测具有良好的应用前景。4、多重IMS-Luminex xMAP检测方法应用于模拟样品的检测及与多重IMS-PCR的比较本试验使用制备的免疫磁珠在最佳条件下捕获样品中的五种弧菌,提取捕获后的样品DNA,分别用多重PCR检测方法和多重Luminex xMAP检测方法进行检测。结果表明,在本次模拟样品检测试验中,当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8 CFU/g时,IMS结合多重Luminex xMAP的检测方法可以在6-7 h内检测出五种弧菌,而IMS结合多重PCR检测方法则检测不出来;但当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8×103 CFU/g时,IMS结合多重PCR检测方法可以在10 h内检测出五种弧菌。该结果证明IMS与多重Luminex xMAP相结合的检测方法,缩短了检测时间,降低了弧菌的检测限,提高了检测的精准度,为检测这五种弧菌提供了快速、简单、高通量及高灵敏性的检测技术。