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背景低氧是实体肿瘤中普遍存在的现象,特别是实体肿瘤内部血供不良的区域更为明显,多种实体肿瘤的研究中发现,低氧微环境与肿瘤的耐药密切相关,那么如何逆转肿瘤的耐药,进一步诱导肿瘤细胞凋亡成为抗肿瘤治疗的关键环节。蟾毒灵（Bufalin）是一种在蟾酥中提取的具有抗肿瘤作用的中药活性成分,属于强心甾体类化合物,以往研究表明其抗肿瘤作用涉及促进凋亡、诱导分化、抑制肿瘤血管新生、抑制肿瘤干细胞生长、增强化疗药物疗效等多个方面。低氧环境下,蟾毒灵能否诱导食管癌细胞凋亡,对食管癌化疗增感的作用目前尚不明确。目的探讨化学物氯化钴（CoCl2）模拟的低氧环境下,蟾毒灵对食管鳞癌ECA109细胞的抑制增殖及对凋亡作用,明确其是否对顺铂（DDP、cisplatin）化疗有增敏作用,并探讨其可能的作用机制。方法1.食管鳞癌ECA109细胞分为:空白对照组（A）、蟾毒灵单药组（B）、DDP组（C）、蟾毒灵+DDP组（D）,其中B组设有5个浓度组（B-a 10nmol/L、B-b25nmol/L、B-c 50nmol/L、B-d 100nmol/L、B-e 200nmol/L）,C组设有5个浓度组（C-a 2.5mg/L、C-b 5.0 mg/L、C-c 7.5mg/L、C-d 10mg/L、C-e 20mg/L）,D组蟾毒灵浓度均为10nmol/L与C组5个浓度联合（联合a组、联合b组、联合c组、联合d组、联合e组）。2.CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖:分别测定氯化钴诱导的低氧环境下,蟾毒灵单药组及DDP单药组不同时间段（24h、48h）的细胞增殖抑制率,选用10nmol/L的蟾毒灵浓度与DDP组联合,检测不同时段（24h、48h）的细胞增殖抑制率。3.流式细胞仪检测低氧环境下,各实验组作用48h后对细胞凋亡的影响。4.Hoechest 33342染色法检测低氧环境下,各实验组作用48h后对细胞凋亡的影响。5.Western Blot法检测低氧环境下,各实验组作用48h后对细胞内的HIF-1α、NF-KBp65及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达情况。（其中4、5、6步实验的分组为:A组、C-b组、C-c组、联合b组、联合c组,分别另命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组）结果1.CCK-8结果显示:低氧环境下,不同浓度的蟾毒灵对ECA109的增殖抑制率均显著高于空白对照组（P<0.05）,且呈浓度依赖性（P<0.05）;在蟾毒灵各浓度组内,作用48h后的细胞增殖抑制率均高于作用24h后（P<0.05）。不同浓度的顺铂对ECAl09的增殖抑制率均高于空白对照组（P<0.05）,呈浓度依赖性（P<0.05）,联合蟾毒灵10nmol/L组的增殖抑制率均高于同浓度单药顺铂组,差异均有统计学意义（P<0.05）,且随着浓度的增加,其对ECAl09细胞生长抑制作用不断增强。2.流式细胞仪检测低氧环境下,药物作用细胞48h后的凋亡率,结果显示当顺铂药物浓度为5.0mg/L时细胞凋亡率为（32.84±4.42）%,顺铂药物浓度7.5mg/L时细胞凋亡率为（43.17±4.03）%,当顺铂5.0mg/L与蟾毒灵10 nmol/L联合时细胞凋亡率为（46.72±3.32）%,当顺铂7.5mg/L与蟾毒灵10 nmol/L联合时细胞凋亡率为（61.22±2.12）%,不同浓度的顺铂均能引起ECAl09的凋亡,呈浓度依赖性（P<0.05）,当与蟾毒灵联合后,则能明显提高其凋亡率（P<0.05）。3.Hoechest 33342染色荧光显微镜下检测低氧环境下,药物作用48h后细胞凋亡形态显示:低氧环境下,对照组细胞形态大小均匀,DDP干预48h后,细胞核浓缩、凋亡小体出现,不同浓度的顺铂对ECAl09的凋亡率均高于空白对照组（P<0.05）,呈浓度依赖性（P<0.05）,联合蟾毒灵10nmol.L-1组的凋亡率均高于同浓度单用顺铂组（P<0.05）。4.Western Blot结果显示:低氧环境下,不同实验药物组作用细胞48h后与空白对照组比较,HIF-1α、NF-KBp65及Bcl-2的蛋白表达量均降低（P<0.05）;与蟾毒灵联合后较顺铂单药组HIF-1α、NF-KBp65及Bcl-2的蛋白表达量均降低（P<0.05）;不同实验组作用细胞48h后与空白对照组比较,Bax的蛋白表达量均升高（P<0.05）;与蟾毒灵联合后较顺铂单药组Bax的蛋白表达量均升高（P<0.05）。结论低氧环境下,蟾毒灵对食管鳞癌ECA109细胞的增殖具有抑制作用,且呈时间浓度依赖性;蟾毒灵可以增加ECA109细胞对顺铂化疗的敏感性。其机制可能是通过抑制NF-KBp65/HIF-1α通路的高表达,进一步导致其下游靶基因Bcl-2的蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平增高,来增强顺铂的抗肿瘤作用。