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根据CA公布的2018年度统计报告，肝癌是全球范围内第六大致死性癌症，其中75％～85％的肝癌病例为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC的发生是一个复杂的多步骤进程，可概括为慢性肝病——肝纤维化——肝硬化——HCC四个阶段。不典型增生肝细胞是肝癌最常见的癌前病变形式，肝脏癌前病变是调控肝癌发生的关键节点。在慢性肝损伤中研究癌前病变细胞的命运调控，控制或逆转癌前病变的进展，探索抑制HCC发生发展的策略，具有非常重要的意义。
细胞衰老(cellular senescence)是细胞永久地退出细胞周期、失去增殖能力的状态。细胞衰老既发生于正常的发育和分化程序中，也发生在细胞遭受不可修复的损伤后，调控细胞衰老的核心因子有p53、p21和p16等。衰老的细胞保持大部分原有功能，同时表现出若干可用于鉴定的表型:调控衰老的p53、p21及p16等因子表达水平上升;衰老细胞溶酶体内半乳糖苷酶异常活化，即衰老相关半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-GAL);衰老细胞分泌因子的组成发生特征性变化，出现衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP);等等。
细胞衰老对肿瘤的作用具有两面性:抑癌通路失效或原癌基因激活都能诱导细胞发生细胞衰老，从而产生抑癌效果;另一方面，细胞衰老也可促进肿瘤细胞的增殖与成瘤能力。慢性肝损伤背景下的细胞衰老与HCC的发生高度相关，分析慢性肝损伤下肝细胞衰老在HCC的发生中的作用，是寻找慢性肝病背景下抑制HCC发生的重要突破口。
在前期工作中，课题组应用肝衰竭小鼠模型——延胡索酰乙酰乙酸水解酶敲除小鼠(fumarylacetoacetate hydrolase knockout mice，Fah-/-)，实现了同一模型下诱导急性或慢性肝损伤。我们的研究发现，急性肝损伤时Fah-/-小鼠肝细胞广泛发生衰老，HCC发生率低;慢性肝损伤下肝细胞不发生衰老，但12周后100％发生HCC。维持Fah-/-小鼠持续8周的慢性肝损伤，再诱导4周急性肝损伤会重新诱导肝细胞进入衰老状态，并激活免疫系统清除衰老细胞，最终显著抑制HCC的发生。然而，通过加重肝损伤诱导肝细胞衰老的方案并不适合在临床推广应用，采用小分子化合物等诱导细胞衰老成为可能的治疗策略。
Fah-/-小鼠慢性肝损伤时伴随着周期蛋白依赖性激酶CDK4/6蛋白水平的上升;同时，慢性肝损伤Fah-/-小鼠的肝细胞在经历急性肝损伤后，p53表达上升，经p53-p21-cyclinD-CDK4/6通路诱导CDK4/6蛋白下调，阻断细胞周期，从而诱导肝细胞发生衰老，肿瘤发生率得以显著降低。CDK4/6能够触发细胞周期从G1期进入到S期，抑制CDK4/6激酶活性可以诱导细胞脱离正常的细胞周期进入细胞衰老。小分子抑制剂PD-0332991能特异性结合于CDK4/6活性位点，阻断CDK4/6启动Rb蛋白的磷酸化，使细胞周期阻断于G1期。本研究通过在慢性肝损伤模型中应用CDK4/6抑制剂PD-0332991诱导肝细胞衰老，观察其在肝癌发生中的作用和机制。
首先，我们观察PD-0332991是否能诱导慢性肝损伤下的肝细胞发生衰老。在诱导慢性肝损伤8周后，我们将Fah-/-小鼠分为三组，分别进行PD-0332991灌胃4周、8周，以不给药小鼠为对照组，期间均继续维持慢性肝损伤的诱导条件不变。处理结束后处死取材，通过冰冻切片和免疫组化检测衰老指标SA-β-GAL和p21的表达情况。PD-0332991灌胃4周及8周后，小鼠肝组织内SA-β-GAL和p21的阳性细胞比例均显著高于对照组(11.57％vs0.67％，p＜0.01;20.07％vs3.10％，p＜0.05)，说明PD-0332991成功诱导了慢性肝损伤下的肝细胞发生细胞衰老。SA-β-GAL和p21阳性细胞均呈现区域分布，以p21免疫组化染色结合H&E染色发现，衰老肝细胞主要分布于肝小叶中央静脉周围，并且表现为细胞体积的增大。
正常肝细胞处于静息状态，停留在细胞周期G0期而很少进入复制状态，而癌前病变细胞则发生异常增生。微染色体维持复合物元件2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)是细胞获得增殖许可的标志物。我们利用MCM2表达鉴定肝细胞脱离静息期并进入异常增殖状态，即癌前病变。MCM2染色结果显示，肝组织内部分细胞出现MCM2阳性，这说明慢性肝损伤下部分肝细胞脱离静息状态，损伤肝细胞脱离静息期进入增殖状态是癌前病变的重要特征。通过MCM2联合p21进行连续切片免疫组化染色，我们发现MCM2阳性细胞均为p21阳性细胞。MCM2与p21双阳性说明慢性肝损伤下PD-0332991选择性诱导脱离静息状态的肝细胞(癌前病变细胞)发生细胞衰老。此外，我们还通过末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL))染色，排除了癌前病变肝细胞发生凋亡的可能。
第二，PD-0332991处理降低了慢性肝损伤下HCC的发生率。经统计，PD-0332991处理4周的Fah-/-小鼠HCC发生率降至16.67％(2/12)，处理8周的Fah-/-小鼠HCC发生率降至25％(2/8)，总体HCC发生率降至20％(4/20)。所有标本经过H&E染色验证，肉眼观察无HCC的肝组织同时在镜下确认无微型HCC癌灶发生。另外，对各组小鼠进行了血清肝功能生化检测，各组小鼠的肝功能指标无统计差异，说明PD-0332991处理对小鼠肝功能没有造成损伤。
第三，发生癌前病变的肝细胞被诱导衰老后进一步被巨噬细胞清除，从而抑制了HCC的发生。文献表明原癌基因激活的肝细胞发生衰老后，能分泌趋化因子CCL2募集巨噬细胞特异性清除衰老细胞。课题组前期实验结果也证实，再次诱发急性肝损伤可诱导Fah-/-小鼠慢性肝损伤过程中异常增殖肝细胞(癌前病变细胞)发生衰老，衰老细胞进一步被浸润的巨噬细胞所清除。本研究中，我们用巨噬细胞标志物F4/80与p21进行连续切片染色，发现PD-0332991处理后的肝组织中，F4/80阳性细胞更多分布在衰老细胞周围，表明PD-0332991可诱导癌前病变的肝细胞发生衰老，进一步激活免疫系统清除衰老细胞从而抑制肝癌的发生。
第四，HCC发生后再进行PD-0332991处理，可诱导癌旁肝细胞的衰老，但不能诱导HCC细胞的衰老。在慢性肝损伤12周诱导HCC发生后，我们将Fah-/-小鼠分为两组，实验组PD-0332991继续灌胃4周处理，对照组不给药。收取肝组织后，进行SA-β-GAL、p21和H&E染色，结果显示肝组织中SA-β-GAL阳性区域和p21阳性细胞围绕HCC结节分布，HCC结节内基本未见衰老细胞分布。表明PD-0332991处理仍能诱导癌旁的异常增殖肝细胞(癌前病变细胞)衰老，但HCC细胞表现为抵抗。
第五，HCC发生后进行PD-0332991处理反而促进了HCC的进展。PD-0332991处理后肉眼可见肝脏密布大量大小不一的HCC结节，肝叶质地较硬。同期慢性肝损伤16周的肝脏仅有若干绿豆大小HCC结节，肝叶光滑柔软。免疫组化染色结果显示，HCC结节内大量细胞表现为MCM2和Ki67阳性，而HCC结节旁的肝组织中MCM2和Ki67阳性细胞均明显少于结节内，说明HCC细胞产生了对PD-0332991的细胞周期抑制作用的抵抗性。
第六，CDK2异常活化和HGF-c-Met通路活化是PD-0332991处理促进HCC进展的可能机制。已有文献表明，PD-0332991通过抑制CDK4/6-Rb-E2F通路活化发挥细胞周期抑制作用，而不敏感乳腺癌细胞系CDK2持续活化，代偿了对CDK4/6的抑制作用，从而产生对PD-0332991耐药性。我们对HCC结节的WB结果显示CDK2磷酸化水平上升，与文献报道一致。同时对癌旁肝组织的测序分析表明，SASP相关细胞因子类型发生变化，其中HGF转录水平显著增加，而HCC结节中c-Met表达水平升高、c-Met下游PI3K和MAPK通路活化。可见，PD-0332991处理诱导癌旁的癌前病变肝细胞衰老，衰老细胞分泌HGF激活HCC细胞c-Met并通过下游PI3K和MAPK通路活化后的促增殖作用最终加速了HCC进展。
通过上述研究表明，在慢性肝损伤过程中，在HCC发生前通过PD-0332991处理抑制CDK4/6活性能诱导癌前病变肝细胞的衰老，进一步激活巨噬细胞清除衰老癌前病变细胞，从而抑制HCC的发生;然而，HCC发生后PD-0332991处理不能诱导CDK2异常活化的HCC细胞发生衰老，但仍能诱导癌前病变肝细胞衰老，衰老癌前病变肝细胞进一步通过SASP因子(HGF)促进了HCC进展。上述实验结果表明，在慢性肝病向HCC进展的不同阶段，诱导细胞衰老的策略可能产生不同的结果:在癌前病变期诱导细胞衰老可通过免疫监控清除衰老的癌前病变细胞，可以显著降低HCC的发生率;而HCC发生后，HCC细胞不仅失去对衰老诱导剂的响应，反而被癌旁衰老癌前病变细胞分泌的SASP因子促进了HCC的进展。
在本研究中，我们首次以慢性肝损伤及其诱导的肝癌模型为研究对象，研究了肝细胞衰老在肝癌发生与发展中的作用和机制;首次在慢性肝损伤下应用CDK4/6抑制剂开展肝细胞衰老的诱导研究，并发现肝癌发生前诱导癌前病变肝细胞的衰老可以抑制肝癌的发生;发现在肝癌发生后PD-0332991处理仍能诱导癌旁癌前病变肝细胞的衰老，但不能诱导肝癌细胞衰老，而且癌旁癌前病变肝细胞的衰老通过衰老分泌表型促进了肝癌的进展。本研究提示应用CDK4/6抑制剂开展肝细胞衰老诱导治疗肝癌时需要慎重选择用药时机，在肿瘤发生前的癌前病变期开展衰老诱导可能才能预防肝癌的发生，目前正在开展的PD-0332991治疗肝癌的临床研究需要慎重评估。
细胞衰老(cellular senescence)是细胞永久地退出细胞周期、失去增殖能力的状态。细胞衰老既发生于正常的发育和分化程序中，也发生在细胞遭受不可修复的损伤后，调控细胞衰老的核心因子有p53、p21和p16等。衰老的细胞保持大部分原有功能，同时表现出若干可用于鉴定的表型:调控衰老的p53、p21及p16等因子表达水平上升;衰老细胞溶酶体内半乳糖苷酶异常活化，即衰老相关半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-GAL);衰老细胞分泌因子的组成发生特征性变化，出现衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP);等等。
细胞衰老对肿瘤的作用具有两面性:抑癌通路失效或原癌基因激活都能诱导细胞发生细胞衰老，从而产生抑癌效果;另一方面，细胞衰老也可促进肿瘤细胞的增殖与成瘤能力。慢性肝损伤背景下的细胞衰老与HCC的发生高度相关，分析慢性肝损伤下肝细胞衰老在HCC的发生中的作用，是寻找慢性肝病背景下抑制HCC发生的重要突破口。
在前期工作中，课题组应用肝衰竭小鼠模型——延胡索酰乙酰乙酸水解酶敲除小鼠(fumarylacetoacetate hydrolase knockout mice，Fah-/-)，实现了同一模型下诱导急性或慢性肝损伤。我们的研究发现，急性肝损伤时Fah-/-小鼠肝细胞广泛发生衰老，HCC发生率低;慢性肝损伤下肝细胞不发生衰老，但12周后100％发生HCC。维持Fah-/-小鼠持续8周的慢性肝损伤，再诱导4周急性肝损伤会重新诱导肝细胞进入衰老状态，并激活免疫系统清除衰老细胞，最终显著抑制HCC的发生。然而，通过加重肝损伤诱导肝细胞衰老的方案并不适合在临床推广应用，采用小分子化合物等诱导细胞衰老成为可能的治疗策略。
Fah-/-小鼠慢性肝损伤时伴随着周期蛋白依赖性激酶CDK4/6蛋白水平的上升;同时，慢性肝损伤Fah-/-小鼠的肝细胞在经历急性肝损伤后，p53表达上升，经p53-p21-cyclinD-CDK4/6通路诱导CDK4/6蛋白下调，阻断细胞周期，从而诱导肝细胞发生衰老，肿瘤发生率得以显著降低。CDK4/6能够触发细胞周期从G1期进入到S期，抑制CDK4/6激酶活性可以诱导细胞脱离正常的细胞周期进入细胞衰老。小分子抑制剂PD-0332991能特异性结合于CDK4/6活性位点，阻断CDK4/6启动Rb蛋白的磷酸化，使细胞周期阻断于G1期。本研究通过在慢性肝损伤模型中应用CDK4/6抑制剂PD-0332991诱导肝细胞衰老，观察其在肝癌发生中的作用和机制。
首先，我们观察PD-0332991是否能诱导慢性肝损伤下的肝细胞发生衰老。在诱导慢性肝损伤8周后，我们将Fah-/-小鼠分为三组，分别进行PD-0332991灌胃4周、8周，以不给药小鼠为对照组，期间均继续维持慢性肝损伤的诱导条件不变。处理结束后处死取材，通过冰冻切片和免疫组化检测衰老指标SA-β-GAL和p21的表达情况。PD-0332991灌胃4周及8周后，小鼠肝组织内SA-β-GAL和p21的阳性细胞比例均显著高于对照组(11.57％vs0.67％，p＜0.01;20.07％vs3.10％，p＜0.05)，说明PD-0332991成功诱导了慢性肝损伤下的肝细胞发生细胞衰老。SA-β-GAL和p21阳性细胞均呈现区域分布，以p21免疫组化染色结合H&E染色发现，衰老肝细胞主要分布于肝小叶中央静脉周围，并且表现为细胞体积的增大。
正常肝细胞处于静息状态，停留在细胞周期G0期而很少进入复制状态，而癌前病变细胞则发生异常增生。微染色体维持复合物元件2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)是细胞获得增殖许可的标志物。我们利用MCM2表达鉴定肝细胞脱离静息期并进入异常增殖状态，即癌前病变。MCM2染色结果显示，肝组织内部分细胞出现MCM2阳性，这说明慢性肝损伤下部分肝细胞脱离静息状态，损伤肝细胞脱离静息期进入增殖状态是癌前病变的重要特征。通过MCM2联合p21进行连续切片免疫组化染色，我们发现MCM2阳性细胞均为p21阳性细胞。MCM2与p21双阳性说明慢性肝损伤下PD-0332991选择性诱导脱离静息状态的肝细胞(癌前病变细胞)发生细胞衰老。此外，我们还通过末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL))染色，排除了癌前病变肝细胞发生凋亡的可能。
第二，PD-0332991处理降低了慢性肝损伤下HCC的发生率。经统计，PD-0332991处理4周的Fah-/-小鼠HCC发生率降至16.67％(2/12)，处理8周的Fah-/-小鼠HCC发生率降至25％(2/8)，总体HCC发生率降至20％(4/20)。所有标本经过H&E染色验证，肉眼观察无HCC的肝组织同时在镜下确认无微型HCC癌灶发生。另外，对各组小鼠进行了血清肝功能生化检测，各组小鼠的肝功能指标无统计差异，说明PD-0332991处理对小鼠肝功能没有造成损伤。
第三，发生癌前病变的肝细胞被诱导衰老后进一步被巨噬细胞清除，从而抑制了HCC的发生。文献表明原癌基因激活的肝细胞发生衰老后，能分泌趋化因子CCL2募集巨噬细胞特异性清除衰老细胞。课题组前期实验结果也证实，再次诱发急性肝损伤可诱导Fah-/-小鼠慢性肝损伤过程中异常增殖肝细胞(癌前病变细胞)发生衰老，衰老细胞进一步被浸润的巨噬细胞所清除。本研究中，我们用巨噬细胞标志物F4/80与p21进行连续切片染色，发现PD-0332991处理后的肝组织中，F4/80阳性细胞更多分布在衰老细胞周围，表明PD-0332991可诱导癌前病变的肝细胞发生衰老，进一步激活免疫系统清除衰老细胞从而抑制肝癌的发生。
第四，HCC发生后再进行PD-0332991处理，可诱导癌旁肝细胞的衰老，但不能诱导HCC细胞的衰老。在慢性肝损伤12周诱导HCC发生后，我们将Fah-/-小鼠分为两组，实验组PD-0332991继续灌胃4周处理，对照组不给药。收取肝组织后，进行SA-β-GAL、p21和H&E染色，结果显示肝组织中SA-β-GAL阳性区域和p21阳性细胞围绕HCC结节分布，HCC结节内基本未见衰老细胞分布。表明PD-0332991处理仍能诱导癌旁的异常增殖肝细胞(癌前病变细胞)衰老，但HCC细胞表现为抵抗。
第五，HCC发生后进行PD-0332991处理反而促进了HCC的进展。PD-0332991处理后肉眼可见肝脏密布大量大小不一的HCC结节，肝叶质地较硬。同期慢性肝损伤16周的肝脏仅有若干绿豆大小HCC结节，肝叶光滑柔软。免疫组化染色结果显示，HCC结节内大量细胞表现为MCM2和Ki67阳性，而HCC结节旁的肝组织中MCM2和Ki67阳性细胞均明显少于结节内，说明HCC细胞产生了对PD-0332991的细胞周期抑制作用的抵抗性。
第六，CDK2异常活化和HGF-c-Met通路活化是PD-0332991处理促进HCC进展的可能机制。已有文献表明，PD-0332991通过抑制CDK4/6-Rb-E2F通路活化发挥细胞周期抑制作用，而不敏感乳腺癌细胞系CDK2持续活化，代偿了对CDK4/6的抑制作用，从而产生对PD-0332991耐药性。我们对HCC结节的WB结果显示CDK2磷酸化水平上升，与文献报道一致。同时对癌旁肝组织的测序分析表明，SASP相关细胞因子类型发生变化，其中HGF转录水平显著增加，而HCC结节中c-Met表达水平升高、c-Met下游PI3K和MAPK通路活化。可见，PD-0332991处理诱导癌旁的癌前病变肝细胞衰老，衰老细胞分泌HGF激活HCC细胞c-Met并通过下游PI3K和MAPK通路活化后的促增殖作用最终加速了HCC进展。
通过上述研究表明，在慢性肝损伤过程中，在HCC发生前通过PD-0332991处理抑制CDK4/6活性能诱导癌前病变肝细胞的衰老，进一步激活巨噬细胞清除衰老癌前病变细胞，从而抑制HCC的发生;然而，HCC发生后PD-0332991处理不能诱导CDK2异常活化的HCC细胞发生衰老，但仍能诱导癌前病变肝细胞衰老，衰老癌前病变肝细胞进一步通过SASP因子(HGF)促进了HCC进展。上述实验结果表明，在慢性肝病向HCC进展的不同阶段，诱导细胞衰老的策略可能产生不同的结果:在癌前病变期诱导细胞衰老可通过免疫监控清除衰老的癌前病变细胞，可以显著降低HCC的发生率;而HCC发生后，HCC细胞不仅失去对衰老诱导剂的响应，反而被癌旁衰老癌前病变细胞分泌的SASP因子促进了HCC的进展。
在本研究中，我们首次以慢性肝损伤及其诱导的肝癌模型为研究对象，研究了肝细胞衰老在肝癌发生与发展中的作用和机制;首次在慢性肝损伤下应用CDK4/6抑制剂开展肝细胞衰老的诱导研究，并发现肝癌发生前诱导癌前病变肝细胞的衰老可以抑制肝癌的发生;发现在肝癌发生后PD-0332991处理仍能诱导癌旁癌前病变肝细胞的衰老，但不能诱导肝癌细胞衰老，而且癌旁癌前病变肝细胞的衰老通过衰老分泌表型促进了肝癌的进展。本研究提示应用CDK4/6抑制剂开展肝细胞衰老诱导治疗肝癌时需要慎重选择用药时机，在肿瘤发生前的癌前病变期开展衰老诱导可能才能预防肝癌的发生，目前正在开展的PD-0332991治疗肝癌的临床研究需要慎重评估。