目的　　腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)已成为一个影响全民健康的重要疾病。在发达国家，AAA在男性人群的发病率已高达3％-9％，女性则为1％-2％。迄今为止，开放手术或腔内手术仍然是AAA唯一的根治方法，而即使在现代医学背景下，AAA破裂的死亡率仍然高达50％以上。　　针对AAA的病因，最近国内外的一些前沿研究正在探索采用药物治疗、基因治疗甚至干细胞的方法，达到控制AAA发展，防止其破裂的目的，同时为小的、无症状的AAA患者以及手术禁忌的AAA患者开辟新的临床治疗途径，并能为适于手术治疗的患者创造有利的治疗时机。microRNA(miRNA，miR)是一种内源性的非编码的小分子RNA，长度大约18～25个核苷酸。它可以通过抑制目标mRNA的翻译过程或者影响目标mRNA的稳定性起到抑制目标mRNA表达的作用，从而在生物体内的各种生理过程中起着重要的调控作用，miR参与多种细胞的增殖、成熟、分化、凋亡以及多种疾病的发生发展。　　我们前期实验证实miR-133a在AAA中表达下调，结合现有文献，假设miR-133a在AAA的发展中可能会起到一定的保护作用。本研究拟在体外验证miR-133a与血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)的关系，体内实验观察miR-133a对AAA进展的影响，并初步探讨其相关机制。　　实验材料与方法　　一、实验动物及主要试剂　　200～250g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠购买于中国医科大学实验动物中心;pluronicF-127、弹力蛋白酶、二甲基亚砜购买于sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购买于HyClone公司;下面是各种蛋白的抗体及其购买公司:α-SMA（SantaCruz公司，美国），OPN（SantaCruz公司，美国），Ki67(abcom公司，美国)，CTGF（SantaCruz公司，美国），DAPI（碧云天公司，中国），MMP-2、MMP-9（abcom公司，美国），lipo-2000（Invitrogen公司，美国），PDGF（美国Peprotech公司）。SP法免疫组织化学试剂盒、DAB显色液（福州迈新公司）;miR-133a专用Real-timePCR试剂盒、miR-133amimic、anti-miR-133a和Scr序列购自上海吉玛制药技术有限公司;人主动脉来源VSMC购自上海拜力生物技术有限公司。　　二、动物模型　　200～250g雄性SD大鼠共30只，共分为5组（每组6只），没有干预措施的包括对照组(0h)6只，实验组6只。所有大鼠经10％水合氯醛腹腔注射麻醉，成功后备皮，腹部正中切口长约3cm切开进腹，撕开后腹膜，自肾动脉水平到腹主动脉分叉处游离腹主动脉，并结扎全部腰动脉分支，腹主动脉分叉处近端穿线备用，于腹主动脉末端穿刺，近端阻断夹阻断，远端丝线系活结，注入弹力蛋白酶（对照组注入生理盐水），保持张力持续5分钟。分别于术后1、2、3、4周超声检查腹主动脉直径。给予干预措施的分为三组，分为盐水对照组，转染组和空白转染组，方法为在注射药物后外膜涂抹lipo-2000和F-127混合的转染序列，取材后4％多聚甲醛固定或液氮中冻存。　　三、EVG染色　　主动脉组织福尔马林固定，二甲苯酒精脱水，石蜡包埋切片。严格按照标准EVG步骤，在普通光学显微镜(TE2000-S，Nikon，Japan)下观察结果。　　四、VSMC细胞培养　　VSMC来源于购买的人主动脉细胞，传代3～4次后转染及检测，培养置于37℃，5％CO2的培养箱中，应用含10％血清的高糖DMEM培养。　　五、细胞及组织免疫荧光染色　　VSMC以104密度生长于24孔板或玻片上，PBS洗涤3次，用多聚甲醛固定，5％BSA室温封闭2小时，一抗4℃孵育过夜，荧光标记二抗室温孵育2小时，Hoechst33258染核。在倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微成像下观察染色情况(FV1000S-SIM/IX81，Olympus，Japan)。主动脉采用冰冻切片染色，一抗4℃孵育过夜，荧光标记二抗室温孵育2小时，DAPI染核。　　六、免疫组织化学检测　　石蜡切片行免疫组织化学检测各组大鼠腹主动脉中MMP-2、MMP-9、CTGF的表达。　　七、Western-Blot　　主动脉组织标本或VSMC置于EP管中，加入适量蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂(PMSF)，匀浆机匀浆或超声破碎细胞，离心后提取蛋白，采用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，蛋白上样量为60μg，体积为20μl。配制10％聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、转膜、封闭（5％脱脂牛奶）、加入一抗4℃孵育过夜，洗膜45分钟，加入过氧化物酶标记的二抗，经37℃孵育2小时后ECL发光(MF-ChemiBis)，并计算光密度值。试验重复3次。　　八、real-timePCR检测miR-133a的表达　　Trizol法提取实验各组细胞及主动脉组织总RNA，异丙醇浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度。取2μL总RNA，用rno-miR-133aHairpin-itTMReal-TimePCRKit按操作说明进行反转录反应。按荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应，U6作为内参。　　九、脂质体介导的miR转染　　应用lipo-2000转染48小时后，在荧光显微镜(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下观察GFP荧光标记，明确转染效率。　　十、细胞迁移检测　　VSMC铺6孔板，转染后24h更换培养基，垂直孔方向划线，分别于4、6、8、12h观察细胞迁移情况。　　十一、统计学分析　　所有数据用均数±标准差表示。组内数据比较采用配对样本t检验。P＜0.05有统计学意义。　　实验结果　　一、miR-133a在合成型VSMC中表达下调　　以同步化后的VSMC作为0小时组，加入小剂量PDGF（10ng/ul）及含血清DMEM培养基刺激48小时后为48h组，再次更换无血清DMEM培养基24小时后作为72h组，real-timePCR结果显示48h组miR-133a在48h组表达明显下调，72h组基本恢复到0小时组水平。　　二、miR-133a可以抑制VSMC的增殖和迁移　　为研究miR-133a与VSMC增殖和迁移的关系，实验分三组转染VSMC:miR-133amimic组、anti-miR-133a组及Scr组（阴性对照），通过免疫荧光染色证实增殖蛋白Ki-67的表达受miR-133a下调，划痕实验结果显示，miR-133a可以抑制VSMC的迁移。　　三、miR-133a可以维持VSMC收缩型表型，抑制VSMC合成型标记物的表达　　采用免疫荧光染色证实在miR-133amimic组，VSMC收缩型的表型标记物a-SMA表达明显比anti-miR-133a组高，而合成型标记物OPN的表达则明显下调，Western-blot的结果得到同样趋势。　　四、miR-133a在腹主动脉瘤中的表达下调　　Real-timePCR检测大鼠AAA标本提示miR-133a在腹主动脉瘤中的表达明显比对照组和正常主动脉降低。　　五、miR-133a体内转染可以抑制大鼠腹主动脉瘤的进展　　大鼠腹主动脉灌注弹性蛋白酶后，应用lip-2000混合F-127作为载体，将miR-133a及对照序列体内转染至腹主动脉外膜，术后超声测量主动脉直径，real-timePCR检测转染效率，结果显示，与对照序列相比，体内转染miR-133a可以明显抑制造模一周后的大鼠腹主动脉直径，但相比灌注盐水的阴性对照，转染组大鼠腹主动脉直径仍有增大。　　六、miR-133a体内转染的大鼠腹主动脉的组织学检测　　免疫荧光染色提示在miR-133a转染组，主动脉壁中的VSMC合成型标记物OPN明显比空白转染组下调，而SMA的表达上调，提示miR-133a在体内可以抑制AAA的进展。免疫组化显示miR-133a转染组动脉壁中MMP-2、9表达明显下调。Western-blot的结果一致。　　七、miR-133a可能通过抑制结缔组织生长因子(CTGF)抑制大鼠腹主动脉瘤　　理论预测CTGF可能存在miR-133a的结合位点，在体外，miR-133a的转染可以抑制CTGF的表达，在体内，miR-133a转染组的CTGF同样表达下降。　　结论　　一、miR-133a在合成型VSMC中表达下调　　二、miR-133a可以抑制VSMC的增殖和迁移　　三、miR-133a可以维持VSMC收缩表型，抑制VSMC合成型标记物的表达　　四、miR-133a在腹主动脉瘤中的表达下调　　五、miR-133a体内转染可以抑制大鼠腹主动脉瘤的进展　　六、miR-133a体内转染可以抑制大鼠腹主动脉瘤中MMP-2/9的表达　　七、miR-133a可能通过抑制CTGF抑制大鼠腹主动脉瘤