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目的:探讨Trim32(tripartite motif32,E3泛素连接酶32)在血管内皮损伤后内膜增生中的作用及相关分子机制。
方法:本研究分为动物实验及细胞实验两个部分,动物实验:为检测Tri m32在血管内皮损伤后增生内膜中的变化,将雄性C57BL/6J小鼠分为假手术组和内皮损伤组,内皮损伤组通过用粗糙金属导丝摩擦损伤小鼠左颈总动脉以建立血管内皮损伤后内膜增生模型,以不用导丝摩擦损伤小鼠左颈动脉,其余手术过程同内皮损伤组一致的小鼠作为假手组。术后常规普通饲料喂养,28天后血管取材,通过实时定量PCR、Western Blotting检测各组小鼠颈总动脉中Trim32的表达情况。为进一步验证Trim32的作用,将小鼠分为假手术+空病毒组、假手术+shTrim32组、内皮损伤+空病毒组、内皮损伤+shTrim32组,shTrim32组采用携带shTrim32的腺病毒注射到左颈总动脉的损伤部位,小鼠随后在手术后7、14、21天通过尾静脉追加shTrim32腺病毒敲低Trim32。空病毒组采用携带阴性对照腺病毒注射到左颈总动脉的损伤部位,小鼠随后在手术后7、14、21天通过尾静脉追加阴性对照腺病毒作为对照;术后28天通过HE染色检测血管内膜增生情况,Ki-67免疫组化染色检测细胞增殖情况。为进一步明确β-catenin是否为Trim32的下游靶点,将小鼠分为内皮损伤+空病毒组、内皮损伤+shTrim32组、内皮损伤+shTr im32+SKL2001组,内皮损伤+空病毒+SKL2001组,SKL2001(β-catenin蛋白激动剂)组通过尾静脉注入SKL2001,术后28天通过HE染色实验观察内膜增生情况。细胞实验:将小鼠血管平滑肌细胞分为溶剂对照组(DMSO组)、重组人血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor-BB,PDGF-B B)组,细胞完全培养基培养24小时,然后提取细胞中的RNA及蛋白质分别采用实时定量PCR、Western Blotting实验检测各组细胞中Trim32的mRNA及蛋白的表达情况;为进一步验证Trim32在血管平滑肌细胞增殖及迁移中的作用,将小鼠平滑肌细胞分为空载体+对照(DMSO)组,siTrim32+对照(DMSO)组、空载体+PDGF-BB组、siTrim32+PDGF-BB组;血管平滑肌细胞siTrim32应用小干扰RNA(siRNA)以沉默平滑肌细胞中Trim32的表达,培养24小时后提取各组细胞中的蛋白质通过Western Blotting检测各组血管平滑肌细胞Trim32及β-catenin的蛋白表达情况;用CCK-8、Ki-67免疫荧光、划痕试验检测各组细胞增殖、迁移的情况。为进一步明确在血管平滑肌细胞增殖迁移过程中,β-catenin是否为Trim32的下游靶点,将细胞分为PDGF-BB+空载体组、PDGF-BB+siTrim32组、PDGF-BB+siTrim32+SK L2001组,各组细胞于相同条件下培养24小时后通过Ki-67免疫荧光及划痕试验检测细胞的增殖与迁移能力。
结果:小鼠内皮损伤后内膜增生模型中Trim32的mRNA及蛋白表达量增加;内皮损伤组中血管内膜增生明显,敲低Trim32表达后,内膜增生明显改善。激动β-catenin后,发现改善后的内膜增生又被逆转。与对照组相比,小鼠血管平滑肌细胞在PDGF-BB干预后,Trim32的mRNA及蛋白表达量增加。敲低Trim32后,β-catenin表达呈下降的趋势,细胞增殖及迁移也呈下降的趋势;应用SKL2001激动β-catenin后,血管平滑肌细胞增殖与迁移下降趋势被逆转。
结论:Trim32可能通过β-catenin途径促进血管平滑肌细胞增殖及迁移,从而在血管内皮损伤后内膜增生的过程中发挥作用。
方法:本研究分为动物实验及细胞实验两个部分,动物实验:为检测Tri m32在血管内皮损伤后增生内膜中的变化,将雄性C57BL/6J小鼠分为假手术组和内皮损伤组,内皮损伤组通过用粗糙金属导丝摩擦损伤小鼠左颈总动脉以建立血管内皮损伤后内膜增生模型,以不用导丝摩擦损伤小鼠左颈动脉,其余手术过程同内皮损伤组一致的小鼠作为假手组。术后常规普通饲料喂养,28天后血管取材,通过实时定量PCR、Western Blotting检测各组小鼠颈总动脉中Trim32的表达情况。为进一步验证Trim32的作用,将小鼠分为假手术+空病毒组、假手术+shTrim32组、内皮损伤+空病毒组、内皮损伤+shTrim32组,shTrim32组采用携带shTrim32的腺病毒注射到左颈总动脉的损伤部位,小鼠随后在手术后7、14、21天通过尾静脉追加shTrim32腺病毒敲低Trim32。空病毒组采用携带阴性对照腺病毒注射到左颈总动脉的损伤部位,小鼠随后在手术后7、14、21天通过尾静脉追加阴性对照腺病毒作为对照;术后28天通过HE染色检测血管内膜增生情况,Ki-67免疫组化染色检测细胞增殖情况。为进一步明确β-catenin是否为Trim32的下游靶点,将小鼠分为内皮损伤+空病毒组、内皮损伤+shTrim32组、内皮损伤+shTr im32+SKL2001组,内皮损伤+空病毒+SKL2001组,SKL2001(β-catenin蛋白激动剂)组通过尾静脉注入SKL2001,术后28天通过HE染色实验观察内膜增生情况。细胞实验:将小鼠血管平滑肌细胞分为溶剂对照组(DMSO组)、重组人血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor-BB,PDGF-B B)组,细胞完全培养基培养24小时,然后提取细胞中的RNA及蛋白质分别采用实时定量PCR、Western Blotting实验检测各组细胞中Trim32的mRNA及蛋白的表达情况;为进一步验证Trim32在血管平滑肌细胞增殖及迁移中的作用,将小鼠平滑肌细胞分为空载体+对照(DMSO)组,siTrim32+对照(DMSO)组、空载体+PDGF-BB组、siTrim32+PDGF-BB组;血管平滑肌细胞siTrim32应用小干扰RNA(siRNA)以沉默平滑肌细胞中Trim32的表达,培养24小时后提取各组细胞中的蛋白质通过Western Blotting检测各组血管平滑肌细胞Trim32及β-catenin的蛋白表达情况;用CCK-8、Ki-67免疫荧光、划痕试验检测各组细胞增殖、迁移的情况。为进一步明确在血管平滑肌细胞增殖迁移过程中,β-catenin是否为Trim32的下游靶点,将细胞分为PDGF-BB+空载体组、PDGF-BB+siTrim32组、PDGF-BB+siTrim32+SK L2001组,各组细胞于相同条件下培养24小时后通过Ki-67免疫荧光及划痕试验检测细胞的增殖与迁移能力。
结果:小鼠内皮损伤后内膜增生模型中Trim32的mRNA及蛋白表达量增加;内皮损伤组中血管内膜增生明显,敲低Trim32表达后,内膜增生明显改善。激动β-catenin后,发现改善后的内膜增生又被逆转。与对照组相比,小鼠血管平滑肌细胞在PDGF-BB干预后,Trim32的mRNA及蛋白表达量增加。敲低Trim32后,β-catenin表达呈下降的趋势,细胞增殖及迁移也呈下降的趋势;应用SKL2001激动β-catenin后,血管平滑肌细胞增殖与迁移下降趋势被逆转。
结论:Trim32可能通过β-catenin途径促进血管平滑肌细胞增殖及迁移,从而在血管内皮损伤后内膜增生的过程中发挥作用。