谷氨酸脱羧酶(GAD)可催化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸(GABA),其催化性能对于GABA生物制备方法的效率具有重要影响。为了获得催化效率高、热稳定性好的GAD,本文以来源于短乳杆菌L.brevis CGMCC 1306的GAD1407为研究对象,分别采用2种理性设计方法对其进行了分子改造:一是通过与嗜热GAD进行多序列比对,识别出了有可能提高酶热稳定性的氨基酸残基替换位点及类型,然后通过计算这些突变对蛋白质自由能的影响,确定了最佳的酶分子改造方案;二是筛选酶分子中柔性高、对热敏感、且不影响酶催化功能的Loop区域,然后分析这些Loop区域中β-转角的结构类型、比较它们的氨基酸残基构成方式与典型构成方式的差异,再用典型构成方式中的氨基酸残基替换那些在对应位点上不一致的氨基酸残基。采用基于PCR的定点突变方法构建了这2种方案设计的突变酶,并测定了这些突变酶的催化效率和热稳定性,获得了多个催化效率和热稳定性都得到提高的突变酶,主要结果有:1.在数据库中搜索嗜热GAD及对应的氨基酸序列,通过多序列比对分析GAD1407与这些嗜热GAD的一级结构差异,识别出有可能提高GAD1407热稳定性的氨基酸残基突变位点和突变方式,再利用Rosetta Cartesian_ddG软件计算不同突变对蛋白质自由能的影响,筛选出可以降低蛋白质自由能、提高蛋白质结构稳定性的突变方式,从而确定酶的分子改造方案。通过定点突变构建相应的突变酶,测定了它们的催化性质并与野生型酶进行比较。结果发现,在所构建的突变酶中,突变酶M190Y的热稳定性和催化效率都高于野生型酶:该突变酶的半失活温度T5015为63.6℃,较野生型(T5015为62.9℃)提高了 0.7℃,其在60℃下的半衰期为34.9min,较野生型(31.0 min)增加了 3.9min;其kcat/Km值为2.86 s-1mM-1,较野生型(kcat/Km为2.10s-1mM-1)提高了 36%。2.通过Chimera、B-fitter等软件分析GAD1407的晶体结构模型,识别出了酶分子非活性部位中柔性较大、易受高温破坏的Loop区域,利用PDBsum数据库分析这些Loop区域中β-转角的结构类型,通过比对这些β-转角的结构与相应的典型结构的氨基酸残基构成差异,确定酶分子改造方案。通过定点突变构建相应的突变酶,测定了它们的催化性质并与野生型酶进行比较。结果表明,突变酶L152P和M415T的催化效率和热稳定性都得到了提高:与野生型相比,它们的kcat/Km分别提高了 202.9%和180.9%,半失活温度T5015分别提高了1.2℃和1.0℃,60℃下的半衰期分别提升了10.8 min和16.2 min。3.利用 Gromacs 软件对野生型和 M190Y、L152P、T153S、A154C、A154G、A154D 和M415T等7个突变酶进行了时长为30ns的分子动力学模拟,通过分析蛋白质骨架运动轨迹和目标区域构象变化,以初步了解氨基酸残基突变改变酶热稳定性的分子机理。研究结果发现:L1 52P突变可以增强Loop6区域的刚性,从而使该Loop前端的α-helix(residue 126-148)与后端的β-sheet(residue 158-165)所构成的α/β超二级结构的刚性得到提高,并对整个酶分子的结构稳定性产生了积极影响。M415T突变可以提高Loop16(residue307-312)的柔性,由于Loop16位于PLP结合域的关键催化区域,所以M415T突变导致催化效率提高的原因可能与其增强了酶活性中心的柔性相关。本文所采用的这两种理性设计方法都较为高效地获得了热稳定性和催化效率同时得到提高的突变酶(L152P、M415T和M190Y),克服了在酶分子改造中常见的催化效率与热稳定性难以同时提高的问题,初步证明了这两种理性设计方法的可行性。从分子改造效果而言,基于β-转角氨基酸残基偏好性改造蛋白质高柔性Loop区域的理性设计方法所获得的突变酶L152P和M415T无论在催化效率还是热稳定性上都显著高于其他突变酶,表明这种理性设计方法具有更好的改造效果,值得进一步的研究、应用和改进。