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绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因,被广泛应用于环境微生物学方面,由于其表达稳定,容易观测,因此,也可以作为启动子活性的报告基因.为了进一步优化短小芽孢杆菌表达系统,以GFP作为报告基因,对克隆自DX01菌株的启动子进行了一系列的研究.采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中的启动子活性片段F1,分别构建了大肠杆菌组成型表达载体pUC118-F1gfp和一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在大肠杆菌DH5α和短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,均观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,gfp基因对2种宿主细胞中实现了组成型表达.该表达结果为Western印迹所证实.对2种宿主表达细胞中GFP蛋白的表达量作了FACS分析,结果表明gfp基因在DX01细胞中的表达强度约为DH5α中的2倍.运用来自噬菌体Mu的转座酶MuA,对启动子F1进行了随机插入突变,从中筛选出13个F1的突变体.对突变体的氯霉素抗性检测表明,与F1对照相比,7个含相应突变体的菌株其氯霉素抗性水平有显著提高,其中突变体Fm3和Fm10抗性提高了3.6倍,可抗高达900μg/mL氯霉素,揭示这些启动子突变体有着更高的启动活性;4个突变体氯霉素抗性水平下降;2个突变体抗性水平基本不变.CAT-ELISA检测的结果,也进一步证实了氯霉素抗性水平的变化与CAT酶活力的变化有着密切的关系.在启动子F1的DNA序列上,存在着不同插入效应敏感位点,在这些位点附近的插入突变,可使启动活性急剧变化,并且相邻的插入位点,其突变效应可能完全不同.FACS分析表明,在大肠杆菌中表现为启动活性增强的F1突变体,转入短小芽孢杆菌DX01后其活性仍表现为增强.采用RT-PCR方法,克隆了萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)的cDNA全长,在该基因的上游连上了一个短小芽孢杆菌47株的中壁蛋白(MWP)信号肽,将Rs-afp1基因的终止密码子突变掉,其后接上绿色荧光蛋白(GFP)基因和T7终止子,分别构建成AFP-GFP融合蛋白表达载体pUC118-F1SPAgfp和pHY300-F1SPAgfp.Western杂交证实融合蛋白在大肠杆菌DH5α中得到了表达.