论文部分内容阅读
研究背景：冠状动脉粥样硬化性心病发病率在欧美等发达国家居首位，在我国亦高居第二，其中急性冠脉综合征的发病率逐渐上升，并呈现向年轻化发展的趋势。如今随着冠脉介入治疗技术的广泛开展，为急性冠脉综合征提供了除溶栓、抗凝等治疗之外的多重临床选择方案，随之也增加了心脏缺血/再灌注损伤的发生率，致使再灌注治疗过程发生严重心血管事件的风险增加，为血管再通治疗带来挑战和困境。然而缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/RI）发生的机制复杂，可导致心肌细胞凋亡增加、炎症反应加重及内皮功能障碍等一系列病理生理变化，到目前为止其发生的具体分子机制仍不明确。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）作为刺激骨髓造血系细胞因子，在临床上主要应用于晚期肾性贫血的治疗。大量研究表明，EPO还具有心脏、肾脏、神经等多组织器官保护作用。但是由于其能够促进红细胞生成，使循环阻力增大，增加红了细胞增多症、高血压、血管栓塞等患者血栓形成的风险，从而使其发挥细胞保护的作用无法在临床上得到真正的应用。促红细胞生成素衍生肽（helix B surfacepeptide，HBSP）是由EPO三级结构衍生而来的多肽，研究显示其在缺血性心脏和神经组织中，表现出与EPO相似的组织保护作用，并证实其无促红细胞生成的作用。然而HBSP对心脏缺血/再灌注损伤的影响尚未见报道。由此，我们研究HBSP能否对大鼠缺血/再灌注损伤心脏发挥保护作用，并研究其发挥心脏保护作用的分子机制。心脏微血管作为心脏组织的重要组成部分，其主要由心脏微血管内皮细胞构成。研究发现当心脏发生I/R损伤时心脏微血管内皮细胞可能是首要累及的部位，因此探讨HBSP能否对I/RI心脏微血管内皮细胞发挥保护作用具有重要意义。本实验以大鼠心脏I/RI为模型，研究HBSP对心脏是否具有保护作用，为缺血/再灌注治疗提供新的思路，并为HBSP的临床应用提供理论依据。研究目的：1.验证HBSP能否对大鼠缺血/再灌注损伤心脏发挥保护作用，并与EPO保护作用相比较。2.探讨HBSP对再灌注损伤心肌的重要作用及其机制。3.观察HBSP对缺血/再灌注损伤心脏微血管内皮细胞的作用。实验方法：1.用200~250g雄性SD大鼠，结扎冠状动脉前降支，缺血30min后，恢复冠状动脉血流灌注，再灌注前5min分别尾静脉注射生理盐水、rhEPO（人重组促红细胞生成素）、HBSP，制备缺血/再灌注模型。2.实验分组：假手术(Sham)组、缺血/再灌注(I/R)组、促红细胞生成素（EPO）组、HBSP组及HBSP+LY294002（PI3k特异性抑制剂，于再灌注前15min静脉注射）组。3.经右颈动脉插管至左心室，检测再灌注3h内血流动力学指标：左室收缩压（LeftVentricular Systolic Pressure，LVSP）和左室内压力变化微分（±LVdp/dt）。采用小动物超声分别检测24h、1w后大鼠心功能，并检测24h大鼠血液红细胞数目。4.再灌注3h后，再次结扎冠状动脉前降支，采用TTC-Evans blue双染法测定梗死面积。5.取心脏组织，切片TUNEL/DAPI荧光标记，利用激光共聚焦显微镜检测心肌细胞凋亡。Western blot法检测心肌组织蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt的表达。6.用150~200g雄性SD大鼠，分离培养大鼠心脏微血管内皮细胞（cardiacmicrovascular endothelial cell，CMEC），制备模拟缺血/再灌注（缺氧/复氧）模型。7.实验分组：对照组(Control)；模拟缺血/再灌注（simulated ischemia reperfusion，SI/R）组；模拟缺血/再灌注+HBSP（SI/R+HBSP）组。8.复氧3h后MTT法检测CMECs细胞活力，TUNEL法检测细胞凋亡。实验结果：1.本实验以心电Ⅱ导联出现ST段抬高性心电图，作为心肌缺血的标志，直至再灌注观测终止时间。2.血流动力学指标检测结果显示，与假手术组比较，缺血/再灌注损伤大鼠心功能明显降低。与I/R组相比，EPO组和HBSP组再灌注前分别静脉给予rhEPO、HBSP后，再灌注3h，大鼠心脏左室收缩压（LVSP）、左室内压最大上升速率（+dp/dtmax）以及最大下降速率（-dp/dtmax）显著升高。3.小动物超声检测结果显示：与Sham组比较，I/R大鼠24h、1w后心功能指标均有不同程度的降低趋势。与I/R组相比，EPO组和HBSP组再灌注24h、1w后左室射血分数（LVEF%）、室间隔厚度（IVSS）及左室短轴缩短率（FS%）显著增加，24h后检测大鼠血液红细胞显示HBSP无促红细胞生成的作用。4.再灌注3h后，TTC-Evans blue双染法梗死面积检测结果显示，与I/R组相比，EPO组和HBSP组心肌梗死面积明显缩小。5.用TUNEL/DAPI荧光标记，利用激光共聚焦显微镜检测再灌注3h后心肌细胞凋亡，与Sham组相比，缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡显著增加；与I/R组相比，EPO组和HBSP组心肌细胞凋亡显著减少；HBSP+LY294002组与HBSP组相比，心肌细胞凋亡显著增加。EPO组和HBSP组间无差异。6.再灌注3h后，Western blot检测Akt和磷酸化Akt的表达，与I/R组相比，HBSP组Akt磷酸化水平显著提高。HBSP+LY294002组与HBSP组相比，Akt磷酸化水平明显降低。7.复氧3h后，MTT法检测各组细胞活力，与对照组相比，SI/R细胞增殖能力明显降低。与SI/R组相比，HBSP+SI/R组CMECs增值能力明显升高。8.细胞爬片固定，各组给予相应处理后，TUNEL法检测细胞凋亡，与对照组相比，SI/R组和SI/R+HBSP组CMECs凋亡明显增多；与SI/R相比，SI/R+HBSP组细胞凋亡明显减少。结论：1.在大鼠缺血/再灌注3h内，HBSP能明显改善心脏收缩、舒张功能；并在24h，1w后的心功能明显优于I/R组。2. HBSP能够激活PI3K-Akt通路显著改善缺血/再灌注损伤大鼠的心脏功能，减少心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡,能够发挥和EPO相似的心脏保护作用，并且无促红细胞生成的作用。3. HBSP对模拟缺血/再灌损伤大鼠心脏微血管内皮细胞有保护作用。