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CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。本论文以茶树咖啡因合成酶编码基因（TCS）为靶基因,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树TCS双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。与此同时,对茶树遗传转化与再生体系进行了优化,并将TCS靶向的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入茶树细胞进行了表达。本文主要研究结果如下:1、构建了茶树咖啡因合成酶基因组编辑载体根据TCS基因组序列设计了两个靶序列T1和T2,并合成相应引物,以pYLgRNA-AtU3d-LacZ载体为模板通过常规PCR扩增技术获得U3d启动子和连接T1靶序列的T1-gRNA片段,以pYLgRNA-AtU3b为模板通过常规PCR扩增技术获得U3b启动子和连接T2靶序列的T2-gRNA片段;采用Overlapping PCR技术将U3d启动子片段和T1-gRNA片段连接在一起组装成T1sgRNA表达盒,采用同样的技术将U3b启动子片段和T2-gRNA片段一起组装成T2sgRNA表达盒;在此基础之上,应用Golden Gate Cloning技术,一步完成T1sgRNA表达盒和T2sgRNA表达盒的拼接,并与pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体整合,从而获得了CRISPR/Cas9介导的TCS基因编辑载体。测序结果发现,在构建的载体序列中检测到T1和T2靶序列,紧接靶序列后检测到gRNA保守序列的存在,同时在T1和T2靶序列上游分别检测到U3d和U3b启动子序列,在T1sgRNA表达盒上游T2sgRNA表达盒下游均检测到了pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体序列。测序结果验证了,T1sgRNA表达盒和T2sgRNA表达盒构建成功,并成功组装入pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体,说明了CRISPR/Cas9介导的TCS基因编辑载体构建成功。2、优化了茶树组织培养再生体系考察了不同茶树品种、外植体和不同诱导条件对茶树细胞脱分化以及再分化的影响,确定了适宜茶树组织培养的茶树品种、外植体以及植物调节剂的比例与组成,完善了茶树组织培养再生体系。结果表明:当选用碧香早茶树品种的叶片作为外植体在含0.1 mg/L TDZ（噻苯隆）+0.1 mg/L IBA（吲哚丁酸）的1/2MS培养基上培养时,愈伤组织诱导率最高,4周内出愈率达到40.96%;当选用湘妃翠品种的子叶作为外植体在含3.0mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）+0.1mg/L NAA（萘乙酸）的1/2MS培养基诱导时,黄绿色的体细胞胚诱导率最高,6周内诱导率达到13.58%;体细胞胚再分化最佳培养基为添加1.0 mg/L 2,4-D（二氯苯氧乙酸）+0.1 mg/L TDZ（噻苯隆）+0.1 mg/L IBA（吲哚丁酸）的1/2MS培养基,在该条件下体细胞胚不定芽发生率为18%;最佳生根培养基为添加1 g/L谷氨酰胺+0.1mg/LGA3+0.15NAA（萘乙酸）的1/2MS培养基,在该条件下4周内能诱导出不定根。3、优化了茶树遗传转化体系通过考察不同外植体、不同的转基因筛选压力、不同农杆菌抑制剂浓度、农杆菌浓度和乙酰丁香酮浓度等因素对茶树遗传转化的影响,确定了较优化的茶树遗传转化体系。结果表明:茶树体细胞胚最适合茶树的遗传转化,而愈伤组织在农杆菌浸染后容易发生褐变致死现象;最佳的筛选压力为50 mg/L的潮霉素;400 mg/L的头孢霉素能有效抑制农杆菌的生长;早期指数生长期是根癌农杆菌侵染的最佳阶段;在菌液中添加150μmol/L乙酰丁香酮时,可有效提高转化率。最后采用本研究建立的茶树遗传转化体系,将CRRSPR/Cas9介导的TCS基因编辑载体成功导入茶树体细胞胚,并进行了表达。