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单增李斯特菌是一种死亡率可达15%～30%、可污染多种食品样品的食源性致病菌。近些年关于鲜活农产品中李斯特菌中毒事件的报道常有出现,而鲜切果蔬、生食三文鱼作为更灵敏的即食性食品,存在易受微生物污染的问题,故本研究以此为切入点,选取鲜切甜瓜、新鲜三文鱼为材料,采用SYBR Green Ⅰ和TaqMan探针两种荧光定量PCR法对单核细胞增多性李斯特菌的快速检测进行研究,旨在建立简便、快捷、特异性强、灵敏度高的检测方法,为保障鲜活农产品的食品安全奠定基础。本论文研究内容共有以下四个方面:(1)根据单核细胞增多性李斯特菌的hly基因设计兼并引物和探针,测序验证。建立荧光定量PCR的反应体系及反应条件,检测兼并引物的特异性。测序结果比对后表明扩增片段与序列同源性达100%,说明两种荧光定量PCR方法设计的兼并引物均能够扩增出特异的电泳条带。两种检测方法的特异性实验中5株单核细胞增多性李斯特菌均为阳性,其它15株非单核细胞增多性李斯特菌均为阴性,表明建立的荧光定量PCR方法特异性较好。(2)比较细菌基因组DNA提取试剂盒和磁珠法细菌DNA提取试剂盒两种方法的优劣,从而确定最优提取方法。利用紫外分光光度法分别比较了这两种提取方法所得DNA的纯度和浓度,结果表明磁珠法细菌DNA提取试剂盒的OD260/OD280及OD260值更高,该法提取效果更好。(3)构建阳性质粒标准品,根据阳性质粒标准品的荧光定量PCR扩增结果建立标准曲线、确定灵敏度。SYBR Green Ⅰ法建立的标准曲线R2=0.9993,线性方程为:y=-3.73x+44.696,R2=0.9955,线性方程为:y=-3.439x+40.36。TaqMan探针法建立的标准曲线R2=0.9912,线性方程为:y=-4.313x+52.182。SYBR Green Ⅰ法检测阳性质粒标准品的灵敏度为7.69× 1 0 copies/μL、1.21 copies/μL,TaqMan探针法检测阳性质粒标准品的灵敏度为1.12×102copies/μL。(4)将建立的荧光定量PCR方法应用于检测人工污染鲜切甜瓜样品和人工污染三文鱼上的单核细胞增多性李斯特菌,建立相应的标准曲线并确定最低检测限。SYBR Green Ⅰ法建立的标准曲线R2=0.9958,线性方程为:y=-3.19x+37.38,R2=0.9955,线性方程为:y=-3.087x+39.503。TaqMan探针法建立的标准曲线R2=0.9939,线性方程为:y=-4.331x+49.693。SYBR Green Ⅰ法对鲜切甜瓜和三文鱼中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为6.28×10 cfu/mL、3.5×102 cfu/mL。TaqMan探针法对鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为6.28×102cfU/mL。