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人体肠道上皮弥散分布大量的肠嗜铬细胞（enterochromaffin cells,EC细胞）,它们以色氨酸为原料,在1型色氨酸羟化酶（Tryptopahan hydroxylase,TPH1）等的催化下生成5-HT。EC细胞是一种可兴奋细胞,在肠内容物的机械或化学刺激下兴奋和释放5-HT。5-HT是一种重要的神经递质,但体内5-HT总量的90%以上均合成并且分泌于肠嗜铬细胞。5-HT通过17型受体发挥调控作用,其中5-HT3为离子通道型受体,其他均为G蛋白偶联受体。EC细胞分泌的5-HT,一方面通过旁分泌和自分泌的方式调控肠道的各种生理功能,另一方面还可以通过血液运输作用于肠道外的器官组织,发挥多种生物学效应。因此研究EC细胞合成和分泌5-HT的调控机制具有重要意义。超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN通道）最初在心脏中被发现,参与窦房结等自律性心肌细胞的起搏电流。研究发现HCN通道有四个亚型,即HNC1-4,它们在外周和中枢神经系统也有较广泛的表达,参与了神经系统功能的调节。HCN通道在静息膜电位-60mV左右可以被激活,阳离子（主要是钠和钙离子）内流使得膜电位向去极化方向改变,从而提高细胞的兴奋性。HCN通道的C末端具有环磷酸腺苷（Cyclic adenosine onophosphate,cAMP）的结合位点,cAMP与之结合可增强HCN通道的激活,在HCN1-4中,HCN2和HCN4对cAMP较敏感。本课题组的前期工作发现大鼠、小鼠和人的肠道EC细胞均特异性表达HCN2通道,在离体的小鼠小肠标本,cAMP可以促进5-HT释放,而HCN通道阻断剂ZD 7288能显著抑制5-HT的基础释放和cAMP引起的释放。这些结果提示HCN2在EC细胞释放5-HT的过程中发挥调控作用。本课题的目的是在细胞模型研究HCN对EC细胞兴奋性的调控作用。EC细胞仅占肠道上皮细胞总数的0.5-1%,因而分离、富集和培养原代EC细胞并进行电生理研究具有较大的技术难度。RIN-14B细胞源自大鼠胰岛神经内分泌瘤,表达TPH2,能合成和分泌5-HT,被认为是一种良好的EC细胞模型。因此本研究采用膜片钳的方法研究HCN通道对RIN-14B细胞兴奋性的影响,并探讨炎症因子TNF-α刺激下RIN-14B细胞兴奋性的变化以及HCN通道在其中的作用,为阐明EC细胞的HCN2通道的生理和病理意义提供科学资料。1.RIN-14B细胞电生理特征研究在电流钳模式下记录RIN-14B细胞,发现它们的静息膜电位介于-55-65mV（均值为-61.34mV）,有趣的是,在未给予刺激的情况下,许多细胞的膜电位呈现出膜电位瞬变。在给予去极化电流刺激时,RIN-14B细胞可以发放动作电位,而且其中部分细胞可以发放连续的动作电位,这说明RIN-14B是一种可兴奋细胞,符合神经内分泌细胞的特征。电压依赖性钠通道阻断剂河豚毒素（TTX,0.1或1μM）可阻断动作电位的发放,而广谱的电压依赖性钙通道阻断剂CdCl2（200μM）对动作电位并没有影响,表明RIN-14B细胞的动作电位是由钠通道所介导发放的,这与文献报道的肠道EC细胞的兴奋性特征相一致。2.RIN-14B细胞表达功能性的HCN通道在电压钳模式下记录RIN-14B细胞,发现在给以-10mV为阶梯从予-60mV到-120mV、时程600 ms的超极化电压刺激时,可以记录到电压依赖性的内向电流,而且这种电流可以被HCN通道的阻断剂ZD 7288（1030μM）所阻断。在电流钳模式下记录时,当给予细胞-140pA超极化电流刺激时,细胞的膜电位会有先超极化后去极化的袋状”sag”现象,这种超极化电流引起的膜电位sag可被ZD 7288所逆转。Ivabradine是一种用于治疗心动过速型心衰的小分子药物,其作用原理是阻断HCN通道介导的起搏电流。我们发现Ivabradine（10100μM）能浓度依赖性地逆转超极化电流刺激RIN-14B细胞所引起的膜电位“sag”现象。这些结果都提示RIN-14B细胞表达功能性的HCN通道。3.HCN通道调控RIN-14B细胞的兴奋性在电流钳模式下记录RIN-14B细胞的静息膜电位,发现ZD 7288（30μM）或Ivabradine（30μM）都能使膜电位发生一定程度的超极化,表明HCN通道在RIN-14B细胞的静息状态会激活,这些激活的HCN通道使得细胞的膜电位发生了去极化,提高细胞兴奋性。随后我们发现RIN-14B细胞在超极化刺激结束时形成反跳去极化,部分细胞反跳去极化会伴随动作电位。反跳去极化是细胞对超极化刺激的一种反馈补偿机制,也是细胞兴奋性的一种特征。当我们给HCN通道的阻断剂ZD 7288或者Ivabradine时均使得,发现反跳去极化会有明显的一个延迟发放,主要体现在反跳去极化的潜伏期加长,幅度减弱,。而部分发放动作电位的反跳去极化基础上的在给HCN通道的阻断剂后动作电位也会消失,。事实上HCN通道的阻断剂本身并不影响钠通道,这些结果进一步提示HCN通道参与RIN-14B细胞兴奋性的调控。4.HCN通道阻断剂逆转TNF-α引起的RIN-14B细胞兴奋性增强用500pg/ml的TNF-α孵育24h后,RIN-14B细胞的兴奋性显著升高,表现为去极化刺激下发放动作电位的概率和频率较对照组细胞显著增加,ivabradine能够显著抑制其动作电位发放。TNF-α处理的细胞超极化电流引起的膜电位sag也较对照组细胞显著增大,提示TNF-α对RIN-14B细胞兴奋性的增强作用与HCN通道表达或功能上调有关。综上所述,本研究通过全细胞膜片钳的方法研究了RIN-14B细胞的电生理特征以及HCN通道对其兴奋性的影响。结果显示RIN-14B细胞具有神经内分泌细胞的电生理特征,是一种非常好的EC细胞模型。同时,我们发现RIN-14B细胞具有典型的HCN通道活动,并且HCN通道参与该细胞静息膜电位和兴奋性的调节。这些结果支持HCN通道在肠道EC细胞分泌5-HT的过程中发挥重要作用,从而为靶向HCN通道来调控肠道5-HT释放进而达到控制和治疗相关疾病提供了实验依据。