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四眼斑水龟(Sacalia quadriocellata Siebenzock, 1903)为濒危等级,其野生种群数量主要因非法贸易等因素正在急剧下降,有效而彻底的保育措施迫在眉睫。人工繁殖是该物种保护的有效措施之一。前人对四眼斑水龟的人工饲养均以只能饲养而不能繁育告终。本课题组从1998年始对其进行人工饲养繁殖实验,在2004年前,未发现任何繁殖现象。作者从2004年开始,从生理学、生态学和行为学等角度进行了一系列诱导繁殖实验和生态养殖实验,首次在人工环境中成功繁殖出子一代四眼斑水龟。分述如下:激素诱导性行为对雄性个体进行了促性腺激素释放激素类似物(LHRH-A)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射实验,注射后使用多媒体数字监控系统对雄性进行行为观察。实验动物分为4组:分别注射LHRH-A(1μg/100 g BW),hCG(200IU),LHRH-A(1μg/100 g BW)+hCG(200IU)和对照组注射生理盐水。实验结果表明:LHRH-A可以有效地诱导四眼斑水龟表现性行为,注射LHRH-A+hCG的个体发情强度高于LHRH-A单独诱导,单独注射hCG和生理盐水均不能诱导发情行为;不同浓度(0.5μg/100 g BW、1μg/100 g BW、2μg/100 g BW)的LHRH-A配合hCG(200IU)同时注射,发情效果无显著差异。本次实验报道了外源注射LHRH-A诱导龟鳖类性行为,尽管LHRH-A诱导发情行为的作用机制尚未证实,本实验能确定LHRH-A能在四眼斑水龟性腺未完全发育的条件下诱导发情。激素影响活动节律为检验LHRH-A和hCG诱导对四眼斑水龟活动节律的影响,将39只四眼斑水龟分成4组:低浓度组(6♀,4♂)、中浓度组(6♀,4♂)、高浓度组(6♀,4♂)和对照组(6♀,3♂),采用不同浓度LHRH-A(0.5μg/100 g BW、1μg/100 g BW、2μg/100 g BW)和hCG(200IU)对动物进行了诱导实验,实验按照10天为一周期,并在注射后对其行为进行24小时的连续跟踪观察,结果如下:激素诱导的个体相对对照组个体日活动节律无显著差异,年活动节律在季节差异显著,差异主要体现在实验组的雌雄个体均出现非常明显的求偶交配行为,对照组未发现发情行为;雄性活动、静息、摄食、其他等行为在四组间没有显著差异,雌性活动、静息、摄食等行为差异极显著,实验组活动量和摄食时间分配显著多于对照组。低浓度诱导的龟发情强度最大,浓度过高LHRH-A的作用受到抑制。卵泡发育周期为评估饲养条件下四眼斑水龟卵巢发育周期,于2007年1月~2008年5月,利用超声波检测(使用韩国产Medison SSA 8800型彩色多普勒超声诊断仪配合阴道探头)每月检测8只雌性四眼斑水龟的腹股沟区域,检测卵黄卵泡(包括生长卵泡和排卵前卵泡)、闭锁卵泡和输卵管卵的大小和数量。结果表明:四眼斑水龟卵巢卵黄卵泡数目和大小呈明显的周期性变化,检测到的卵黄卵泡长径范围为4～24mm(n=186)。8月份环境温度开始下降,此时卵泡数目开始增多,卵泡长径逐渐增大,至12月份排卵前期卵泡数量达最大值,卵巢发育成熟。排卵前期卵泡长径范围为19～24mm(n=56),最大排卵前期卵泡出现于12月。排卵时间是1月至3月。闭锁卵泡长径范围在10～20mm(n=14)之间,仅在10月至次年3月能检测到少数的闭锁卵泡。激素诱导卵泡发育在四眼斑水龟卵泡发育期(8-10月),将12只雌性四眼斑水龟采用LHRH-A、HCG对动物进行卵泡发育诱导试验,采用B超和X光检测技术检查龟卵的发育情况。发现实验组的雌性个体出现怀卵现象,并成功产下受精卵,而对照组也未出现怀卵现象。在前一次实验的基础上,使用18只雌性个体,分成3个组,每组6只个体:低浓度组(LHRH-A 0.5ug/100g BW, hCG 200IU),高浓度组(LHRH-A 8ug/100g BW, hCG 200IU)和对照组(生理盐水)。结果发现,低浓度可以有效地诱导雌性四眼斑水龟卵泡发育(χ2=11.645, df=2, P=0.003);使用在非繁殖期进行LHRH-A和hCG诱导,没有显著地卵泡发育(Mann-Whitney U=1777.5, P=0.856)。实验结果证明LHRH-A对四眼斑水龟卵泡发育有双重作用,其影响方式受到激素浓度的影响,较低浓度可以有效地诱导卵泡发育。产卵与孵化室内养殖条件下,四眼斑水龟产卵行为出现在1月至6月间,四月份是产卵高峰。年产一窝,平均窝卵数为2.47枚(n=34, range=1-4),大部分个体产2-3枚(76.5%)。平均蛋重12.8±1.7 g (n=71, range=8.9-16.9 g),平均长径42.9±3.0 mm (n=71, range=35.4-49.4 mm);平均短径22.1±1.0 mm(n=71, range=20.2-24.1 mm);受精率22.6% (19/84)。稚龟平均背甲长39.10 mm(n=4, range 37.32-41.48 mm),平均体重8.46 g(n=4, range 7.40-9.63 g)。有雨天气和无雨天气的四眼斑水龟产卵行为出现有极显著差异(χ2>30,df=1,P<0.01),即雨天可能是诱导四眼斑水龟产卵的一个重要因素;窝卵数与体重,背甲长有关;在环境温度为24-27°C条件下,孵化期105.9 d(n=9, 89-122 d),共孵出9只个体。生态养殖以上实验结果证实了饲养环境不适导致四眼斑水龟性腺发育不良和激素分泌量下降,最终导致繁殖障碍。为探究出一套适用性较强并易于付诸大规模养殖推广的技术,满足人们对该物种的大量需求及减轻野生种群的压力,实现成功繁殖且保证成功繁殖出的个体无外源激素污染的负面影响,作者自2007年1月至2009年12月,开展了一系列生态养殖法的研究,在饲养条件下通过改变饲养环境、光周期、食物组成等。结果表明:饲养于生态池中的雌性个体产卵数量显著多于室内养殖个体;使用改良后混合饲料投喂产卵数量增加;短日照组卵泡发育情况好于长日照;延长雌雄混放时间有利于提高受精率。通过生态养殖法,成功突破了四眼斑水龟在人工养殖条件下的繁育问题,为其他濒危龟类的人工驯养繁殖提供了范例。